Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Resumo

Aqui, apresentamos um ensaio de cocultura fácil de usar para analisar a migração de glioblastoma (GBM) em neurônios padronizados. Desenvolvemos uma macro no software FiJi para fácil quantificação da migração celular GBM em neurônios, e observamos que os neurônios modificam a capacidade invasiva celular GBM.

Resumo

Glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grau IV, são um dos tipos mais mortais de câncer humano por causa de suas características agressivas. Apesar dos avanços significativos na genética desses tumores, como as células GBM invadem o parenchyma cerebral saudável não é bem compreendida. Notavelmente, foi demonstrado que as células GBM invadem o espaço peritumoral através de diferentes rotas; o principal interesse deste artigo é a rota ao longo de tratos de matéria branca (WMTs). As interações das células tumorais com os componentes das células nervosas peritumorais não são bem caracterizadas. Aqui, foi descrito um método que avalia o impacto dos neurônios na invasão celular GBM. Este artigo apresenta um ensaio avançado de cocultura in vitro que imita a invasão de WMT analisando a migração de células-tronco GBM em neurônios. O comportamento das células GBM na presença de neurônios é monitorado usando um procedimento de rastreamento automatizado com software de código aberto e de acesso livre. Este método é útil para muitas aplicações, em particular, para estudos funcionais e mecanicistas, bem como para analisar os efeitos de agentes farmacológicos que podem bloquear a migração celular GBM em neurônios.

Introdução

Gliomas malignos primários, incluindo GBMs, são tumores devastadores, com uma taxa média de sobrevivência de 12 a 15 meses relatada para pacientes com GBM. A terapia atual conta com grande ressecção de massa tumoral e quimioterapia aliada à radioterapia, que só aumenta a taxa de sobrevivência em poucos meses. As falhas terapêuticas estão intimamente relacionadas ao mau fornecimento de drogas através da barreira hematoencefálica (BBB) e ao crescimento invasivo em espaços perivasculares, meninges e ao longo das OTN¹. A invasão perivascular, também chamada de co-opção vascular, é um processo bem estudado, e os mecanismos moleculares estão começand....

Protocolo

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com os regulamentos do comitê de ética local). Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa humana e animal da Universidade de Bordeaux. Ratos grávidas foram alojados e tratados na instalação animal da Universidade de Bordeaux. A eutanásia de um rato grávida cronometrado E18 foi realizada usando CO₂. Todos os procedimentos de animais foram feitos de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo comitê de ética local. Todos os produtos comerciais são referenciados na Tabela de Materiais.<....

Resultados

Neurônios padronizados co-cultivados com células GBM fluorescentes foram preparados como descrito na seção de protocolo, e experimentos de rastreamento foram realizados. As células GBM modificaram rapidamente sua forma enquanto migravam nos neurônios(Figura 1B: painel 6 e vídeo 1). As células migraram ao longo das extensões neuronais, em um movimento aleatório(Vídeo 1). Células GBM fluorescentes e neurônios não fluorescentes po.......

Discussão

Glioblastomas invadem extensivamente o parenchyma usando diferentes modos: co-opção de vasos sanguíneos circundantes, invasão intersticiacional ou invasão em WMTs¹⁸. Este último modo não é bem caracterizado na literatura devido à dificuldade em encontrar modelos in vitro ou in vivo adequados relacionados à invasão de WMT. Aqui, foi proposto um modelo simplificado no qual neurônios de roedores cultivados foram padronizados em superfícies revestidas de laminina, e cél.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells