Um grande modelo animal para lesão renal aguda por oclusão bilateral temporária da artéria renal

Resumo

Este estudo apresenta um modelo animal de grande porte altamente reprodutível de isquemia renal-reperfusão em suínos usando oclusão bilateral de balão-cateter percutâneo temporário das artérias renais por 60 min e reperfusão por 24 h.

Resumo

A lesão renal aguda (AKI) está associada a maior risco de morbidade e mortalidade pós-operatória. A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) é a causa mais comum de AKI. Para imitar este cenário clínico, este estudo apresenta um modelo animal de grande porte altamente reprodutível de IRI renal em suínos utilizando oclusão bilateral percutânea temporária das artérias renais. As artérias renais são ocluídas por 60 minutos introduzindo os cateteres de balão através da artéria femoral e carótida e avançando-as para a porção proximal das artérias. O contraste iodinado é injetado na aorta para avaliar qualquer opificação dos vasos renais e confirmar o sucesso da oclusão da artéria. Isso é ainda confirmado pelo achatamento da forma de onda de pulso na ponta dos cateteres de balão. Os balões são esvaziados e removidos após 60 minutos de oclusão bilateral da artéria renal, e os animais podem se recuperar por 24h. Ao final do estudo, a creatinina plasmática e o nitrogênio da ureia sanguínea aumentam significativamente, enquanto o eGFR e a produção de urina diminuem significativamente. A necessidade de contraste iodinado é mínima e não afeta a função renal. A oclusão renal bilateral imita melhor o cenário clínico da hipoperfusão renal perioperatória, e a abordagem percutânea minimiza o impacto da resposta inflamatória e o risco de infecção vista com uma abordagem aberta, como a laparotomia. A capacidade de criar e reproduzir esse modelo suíno clinicamente relevante facilita a tradução clínica para humanos.

Introdução

Lesão renal aguda (AKI) é uma condição comumente diagnosticada entre pacientes cirúrgicos associados à morbidade e mortalidade^{significativas 1,2}. Os dados disponíveis mostram que a AKI pode afetar até metade de todos os pacientes hospitalizados em todo o mundo e leva a 50% de taxa de mortalidade em pacientes na unidade de terapia intensiva^1,3. Apesar de sua alta prevalência, a terapia AKI atual permanece limitada a estratégias preventivas, como manejo de fluidos e diálise. Portanto, há um interesse contínuo em explorar terapias alternativas para aki^4,5,6.

AKI é tipicamente classificada em pré-renal, intrínseca e pós-renal com base em sua etiologia^4,5,6. A maioria dos pacientes cirúrgicos com AKI estão associados a causas pré-renais devido à hipovolemia, resultando em lesão de isquemia-reperfusão (IRI) dos rins². Clinicamente, a produção de urina diminui, e os níveis de creatinina aumentam devido à diminuição da função renal. O rim é um órgão de alta taxa metabólica e suscetível à isquemia. Um modelo animal de grande porte altamente reprodutível de IRI renal é necessário para obter uma melhor visão da fisiopatologia da AKI e suas potenciais abordagens terapêuticas⁵.

Para imitar o cenário clínico da hipoperfusão renal peri-operativamente, um modelo de oclusão bilateral da artéria renal é considerado adequado. Modelos descritos anteriormente que implicam oclusão unilateral da artéria renal com ou sem ressecção do rim contralateral não fornecem aplicabilidade clínica suficiente^7,8. Embora esses modelos sejam suficientes para causar AKI, eles não se assemelham a cenários clínicos da vida real nem em termos de tipo nem duração da lesão.

O objetivo deste artigo é apresentar um modelo suíno de oclusão temporária bilateral percutânea das artérias renais por oclusão de cateter de balão sob angiografia. A oclusão da artéria renal bilateral imita o cenário clínico da hipoperfusão renal, seguida da posterior remoção do balão para reperfusão^9,10. As etapas técnicas são descritas, incluindo cateterismo, orientação de cateteres, angiografia e monitoramento hemodinâmico. Este método não só permite uma oclusão altamente controlada e replicável das artérias renais, mas a abordagem percutânea minimiza o impacto da resposta inflamatória limitando a quantidade de insulto ao corpo em comparação com uma abordagem aberta.

Protocolo

Todos os estudos in vivo foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde sobre cuidados e uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (Protocolo 18-06-3715). Todos os animais receberam cuidados humanos em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1 mostra a linha do tempo, incluindo anestesia, preparação cirúrgica e pontos de tempo para medições de desfechos primários deste estudo.

1. Indução, anestesia e intubação

1. Para evitar estresse e desconforto desnecessários, sedeia os suínos por injeção intramuscular de uma mistura de tiletamina/zolazepam 4-6 mg/kg e xilazina 1,1-2,2 mg/kg, bem como isoflurano 3% usando uma máscara facial.
2. Cannula a veia auditiva para obter acesso venoso com uma cânula de 20 G IV após desinfetar a área com 95% de etanol. Inicie uma infusão de manutenção (0,9% NaCl a 5 mL/kg/h).
3. Entubar o porco com um tubo endotraqueal (tamanho 7 para suínos que pesam 40-50 kg) uma vez que a adequação anestésico é confirmada. Realize a ventilação de balão com uma frequência de 12 respirações/min e transporte o porco para o centro cirúrgico.
4. Coloque o animal na mesa de operação na posição supina. Inicie imediatamente a ventilação de pressão positiva mecânica com fio₂ 0,50, volume de maré de 10 mL/kg e uma frequência de 12 respirações/min sob capnografia contínua.
5. Coloque um oxímetro de pulso na orelha ou no lábio inferior para monitoramento contínuo.
6. Mantenha a normotermia (37 °C) usando uma almofada aquecida a ar.
7. Para manter a anestesia geral, mantenha a administração isoflurane em 0,5-4% através do tubo endotraqueal. Durante todo o procedimento, monitore continuamente o ECG, a pressão arterial, a temperatura e a capnografia para medir a profundidade da anestesia.
8. Insira um cateter Foley para verificar o estado do fluido do animal e monitore a saída de urina coletando urina em um saco de drenagem.
   NOTA: Os suínos fêmeas são preferidos em relação aos machos devido às características anatômicas de sua uretra que permite um cateterismo mais fácil.

2. Preparação cirúrgica e acesso vascular

1. Coloque o animal de forma estéril.
2. Desinfete a área lateral direita do pescoço aplicando betadina e, em seguida, 95% de etanol por 3 vezes.
3. Realize um corte para o cateterismo da artéria carótida direita e da veia jugular direita. Retraia o músculo esteterocleidomastoide lateralmente e disseque-o até a artéria carótida direita e a veia jugular direita.
4. Insira uma bainha de angiografia 5F tanto na artéria quanto na veia. Fixá-lo com uma sutura de seda 2-0.
5. Insira uma baia de angiografia 5F utilizando a técnica Seldinger na artéria femoral esquerda.
   1. Para executar a técnica Seldinger punem a artéria femoral usando uma agulha oca. Insira um fio-guia de ponta macia através do lúmen e avance-o para a artéria femoral.
   2. Segure o fio-guia seguro com a mão enquanto remove a agulha. Passe a baia de angiografia sobre o fio guia para a artéria femoral e retire o fio-guia. Use orientação de ultrassom, se necessário.

3. Indução de isquemia renal-reperfusão lesão

1. Administre 200 UI/kg de heparina de sódio por via intravenosa para alcançar a anticoagulação sistêmica (tempo de coagulação ativado por alvo (ACT) > 300 s).
2. Realize uma angiografia injetando um agente de contraste iodinaado sob fluoroscopia para identificar as artérias renais.
   NOTA: Para reduzir o risco de nefrotoxicidade induzida por contraste, diluir o agente de contraste iodinaado em uma solução 1:1 com soro fisiológico normal. Tabular a dosagem para todos os animais para garantir a dosagem equivalente.
3. Identifique as artérias renais, avance manualmente o fio-guia no cateter guia.
4. Posicione o cateter guia JL4 5F na artéria renal esquerda através da artéria carótida direita(Figura 1A).
5. Posicione o segundo cateter guia 5F JL4 na artéria renal direita através da artéria femoral esquerda(Figura 1A).
6. Use os fios-guia para direcionar um cateter de dilatação transluminal percutânea de 5F (PTA) em cada artéria renal.
   NOTA: É preferível posicionar o balão na artéria renal proximal para que nenhum ramo ou garantia da artéria renal seja deixado patente após a inflação do balão.
7. Posicione cada cateter de balão no lugar e conecte uma linha de pressão a cada cateter.
8. Verifique a presença de formas de onda de pulso arterial no monitor de pressão para garantir o posicionamento correto do cateter.
9. Infle cada balão e aponte para uma pressão de aproximadamente 2,5 atm dentro do balão(Figura 1B).
10. Para confirmar a cessação do fluxo sanguíneo para os rins observe o achatamento da forma de onda de pulso na ponta do cateter de balão.
11. Injete meio de contraste iodinaado (diluição 1:1) e verifique se há alguma opacificação dos vasos renais.
    NOTA: Também é possível encher o balão com um agente de contraste iodinado para visualização do balão inflado. No entanto, este método não é tão sensível quanto o achatamento da forma de onda de pulso para confirmar a oclusão das artérias renais.
12. Após 60 minutos de oclusão, esvazie cuidadosamente e remova os cateteres de balão das artérias renais.
13. Realizar uma angiografia (utilizando meio de contraste diluído 1:1) para confirmar a patência da artéria renal e o estabelecimento de reperfusão renal(Figura 1C).
14. Remova a baia de angiografia 5F da artéria femoral esquerda.
15. Aplique pressão firme no local do cateterismo por 30 minutos.
16. Inverta o efeito da heparina pela administração de protamina (3 mg/kg) até que o ACT se normalize.
17. Para provar urina durante o período pós-operatório, fixe um tubo no cateter Foley com uma sutura de seda 2-0 usando um ponto interrompido na pele.
18. Deixe as bainhas de angiografia na artéria carótida direita e na veia jugular direita no lugar e fixe-as com uma sutura de seda 2-0 usando um ponto interrompido para permitir a amostragem de sangue durante todo o estudo.
19. Feche a incisão do pescoço com uma sutura de seda 2-0 usando um ponto contínuo em 2 camadas.
20. Administre bupivacaína (3 mg/kg) no local da incisão para minimizar a dor.
21. Continue hidratando o animal com 0,9% de NaCl a 5 mL/kg/h para um total de 2h após o fim da isquemia.
22. Coloque um remendo de fentanil (25-50 μg/h) na parte de trás do animal para minimizar a dor pós-operatória.
23. Administre uma injeção intramuscular de buprenorfina (0,005-0,1 mg/kg) para minimizar a dor pós-operatória.
24. Monitore o animal e mantenha-o em ventilação mecânica até acordar.

4. Recuperação animal

1. Após acordar, acomode o animal em uma sala controlada pela temperatura.
2. Continue a girar o animal de um lado para o outro até que ele recupere a consciência plena e a capacidade de ambulação.
3. Fornecer água e comida ad libitum.

5. Avaliação funcional

1. Coletar o sangue e as amostras de urina de acordo com o protocolo desejado.
   NOTA: Neste estudo, foram designados os seguintes pontos de tempo: linha de base (1h após início do protocolo de hidratação e antes da oclusão das artérias renais), fim da isquemia e reperfusão (2h, 6h, 24h).
2. Recolhe as amostras de sangue arterial e venoso. Armazene-os em heparina de lítio ou vacutainers revestidos EDTA para análise posterior.
   NOTA: Retire o sangue diretamente dos cateteres na artéria carótida e na veia jugular.
3. Colete as amostras de urina do cateter Foley e armazene-as em tubos de 15 mL para análise.
   NOTA: Recolher a urina do saco de drenagem ligado ao cateter Foley.
4. Para determinar a saída de urina, esvazie o saco de drenagem e colete urina por 1h.
   NOTA: Para o ponto de tempo de 6h em que um saco de drenagem não está conectado ao cateter Foley, feche o tubo conectado ao cateter Foley por 30 minutos e, em seguida, colete a urina com uma seringa de 60 mL para determinar a saída de urina.

6. Eutanásia

1. Após o término do período de reperfusão, realize anestesia e monitor conforme descrito acima.
2. Continue hidratação com 0,9% De LNA a 5 mL/kg/h.
3. Use os cateteres arteriais e venosos para amostragem de sangue e o cateter Foley para determinar a saída de urina. Colete as amostras finais de sangue e urina e calcule a saída de urina.
4. Realize uma incisão de laparotomia midline de 15 cm usando uma lâmina tamanho 10 do xifoide até a pelve média.
5. Use um retrátil lateral reto para retrair a pele abdominal.
6. Dissecar os anexos peritários laterais da parede abdominal para expor o retroperitônio direito e esquerdo.
7. Identificar e dissecar sem rodeios as artérias e veias renais.
8. Ligate as artérias renais e as veias com uma sutura de seda 2-0 e realize nefrectomias bilaterais para coletar amostras de tecido inteiro para análise histológica e metabólica.
9. Eutanásia do animal com o método preferido de eutanásia (por exemplo, exsanguinação, pentobarbital)

Resultados

Análise funcional
Os resultados representativos deste estudo são de 6 animais e os dados apresentados são médias ± erro padrão da média. A função renal é avaliada pela determinação da saída de urina, taxa de filtração glomerular estimada (eGFR), creatina plasmática e nitrogênio de ureia sanguínea (BUN). Os biomarcadores da função renal são avaliados por meio de um analisador de química portátil. eGFR é calculado de acordo com a seguinte fórmula: eGFR =1,879 × BW^1.092

Discussão

AKI é uma doença clínica comum que afeta até 50% dos pacientes adultos hospitalizados em todo o mundo^6,12. Um modelo animal clinicamente relevante é necessário para investigar melhor a fisiopatologia da doença e potenciais alvos terapêuticos. Embora existam vários modelos murinos replicando AKI, estes não imitam completamente seus respectivos cenários clínicos e a anatomia do rim humano. Este estudo propõe um modelo suíno clinicamente relevante para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM