Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração

Resumo

Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.

Resumo

Um protocolo de extração de DNA recentemente publicado usando contas magnéticas e um instrumento automatizado de extração de DNA sugeriu que é possível extrair DNA de alta qualidade e quantidade de um mosquito individual bem preservado suficiente para sequenciamento de genoma a jusante. No entanto, a dependência de um caro instrumento automatizado de extração de DNA pode ser proibitiva para muitos laboratórios. Aqui, o estudo fornece um protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas, que é adequado para baixo a médio rendimento. O protocolo descrito aqui foi testado com sucesso utilizando amostras individuais do mosquito Aedes aegypti. Os custos reduzidos associados à extração de DNA de alta qualidade aumentarão a aplicação de sequenciamento de alto rendimento a laboratórios e estudos limitados de recursos.

Introdução

O desenvolvimento recente de um protocolo de extração de DNA^{melhorado 1} permitiu muitos estudos de alto impacto a jusante envolvendo sequenciamento de genoma inteiro^2,3,4,5,6. Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas fornece um rendimento de DNA confiável de amostras individuais de mosquitos, o que, por sua vez, reduz o custo e o tempo associados à aquisição de um número suficiente de amostras de coleções de campo.

Os recentes avanços....

Protocolo

1. Armazenamento geral de amostras e preparações antes da extração de DNA

1. Hidrate a amostra em 100 μL de água de grau PCR por 1h (ou durante a noite) a 4 °C se a amostra tiver sido armazenada em >70% de álcool para suavizar o tecido.

2. Interrupção da amostra

1. Coloque uma incubadora ou bloco de calor tremendo a 56 °C.
2. Faça a mistura tampão/enzima proteinase K (PK). 2 μL de Proteinase K (100 mg/mL) e 98 μL de Proteinase K Buffer (total de 100 μL) é necessário para cada extração individual de mosquitos. Para preparar uma mistura mestre para várias amostras, aumente a quantidade total (combinada para todas as....

Resultados

O rendimento médio de DNA por tecido de cabeça/tórax de mosquito individual foi de 4,121 ng/μL (N = 92, desvio padrão 3.513) medido utilizando um fluorômetro quando eluido usando 100 μL de tampão de elução. Isso é suficiente para os requisitos de entrada de DNA genômico de 10-30 ng necessários para toda a construção da biblioteca de^{genomas 1,7}. A quantidade de DNA pode variar entre 0,3-29,7 ng/μL, dependendo do tamanho do corpo do mosquito e das c.......

Discussão

O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para outras espécies de insetos. A versão original do protocolo introduzido em Nieman et al.¹ foi testada em várias espécies, incluindo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, e Keiferia lycopersicel.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AE Buffer	Qiagen	19077	Elution buffer
AL Buffer	Qiagen	19075	Lysis buffer
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Washing buffer 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Washing buffer 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	magnetic bead
Magnetic bead separator	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	microvolume spectrophotometer
PK Buffer	ThermoFisher	4489111	Proteinase K buffer
Proteinase K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorometer