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  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Uma lesão escalda transitória (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) de uma pata traseira diminui o limiar (g) para a estimulação de filamento von Frey do lado ipsilateral e altera o padrão de marcha. Além disso, a lesão por queimadura induz o comportamento depressivo no teste de natação forçada.

Resumo

A água escaldante é a causa mais comum de queimaduras em populações idosas e jovens. É um dos principais desafios clínicos devido à alta mortalidade e sequelas em países de baixa e média renda. Queimaduras frequentemente induzem dor espontânea intensa e intolerância persistente, bem como problema de risco de vida. Mais importante, a dor excessiva é frequentemente acompanhada de depressão, o que pode diminuir significativamente a qualidade de vida. Este artigo mostra como desenvolver um modelo animal para o estudo da dor induzida por queimaduras e comportamento semelhante à depressão. Após anestesia, a lesão por queimadura foi induzida por mergulhar uma pata traseira do rato em água quente (65 °C ± 0,5 °C) para 3 s. O teste von Frey e a análise automatizada da marcha foram realizados a cada 2 dias após a lesão por queimadura. Além disso, o comportamento semelhante à depressão foi examinado por meio do teste de natação forçada, e o teste de rotação-vara foi realizado para diferenciar a função motora anormal após lesão por queimadura. O principal objetivo deste estudo é descrever o desenvolvimento de um modelo animal para o estudo da dor induzida por queimaduras e comportamento semelhante à depressão em camundongos.

Introdução

Danos teciduais, como queimaduras e traumas, geralmente estão associados à co-ocorrência de dor aguda. Lesões por queimaduras e sintomas relacionados ao trauma são estimados em 1.80.000 mortes por ano causadas por queimaduras - a grande maioria ocorre em países de baixa e média renda de diferentes tipos de queimaduras1. De acordo com um relatório mundial, as queimaduras são comuns em crianças e representam cerca de 40%-60% dos pacientes hospitalizados 2,3. Essas lesões específicas são ainda mais graves, pois podem ocorrer no dia a dia, como ferver ou tomar banho4,5. Embora a dor aguda possa ser resolvida espontaneamente após a recuperação de danos teciduais na maioria dos casos, pode ser possível tornar-se crônica devido a alterações anormais no sistema nervoso 6,7.

Recentemente, foi sugerido que a dor aguda pode induzir um humor deprimido, e a dor crônica pode causar ansiedade e depressão 8,9,10,11. A convivência da dor e da depressão dificulta o tratamento do paciente. A depressão também tende a aumentar a sensibilidade à dor, o que provavelmente induzirá depressão mais intensa e dor12. Complicações de dor e depressão são mostradas em modelos animais de inflamação periférica 13,14,15,16. Os mecanismos detalhados subjacentes à depressão induzida pela dor não são bem conhecidos até agora, 17 anos. Assim, é necessário desenvolver tratamentos mais eficazes para queimaduras para aliviar os efeitos colaterais e sintomas.

Assim, o presente estudo foi projetado para desenvolver um modelo animal para estudar dor aguda induzida por lesões de queimaduras e comportamento semelhante à depressão em camundongos. Para isso, foram medidas sensibilidade tátil anormal relacionada à lesão, padrão de marcha alterado e comportamento semelhante à depressão. Além disso, este estudo tenta validar o modelo usando NSAIDs.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Chungnam, na Coreia do Sul, e depois conduzidos com base nas diretrizes éticas da Associação Internacional para o Estudo da Dor18.

1. Indução de queimadura escaldante na pata traseira

  1. Abriga os camundongos machos ICR pesando 20-25 g em uma sala controlada por luz e temperatura (ciclo claro-escuro de 12/12 h, 22,5 °C ± 2,5 °C) com umidade de 40%-60%.
    NOTA: Tanto camundongos machos quanto fêmeas podem ser usados para este protocolo.
  2. Permita ao animal acesso livre a alimentos e água, e aclimata por pelo menos 1 semana antes de iniciar o experimento.
    NOTA: Todos os animais foram agrupados para excluir variáveis como o estresse de isolamento.
  3. Atribua os ratos aleatoriamente ao grupo experimental ou controle e realize experimentos cegos usando números de animais como códigos.
  4. No dia da indução da queimadura, anestesia o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de 300 μL de alfaxalona a uma dose de 100 mg/kg. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização da indução de queimadura.
  5. Depois de anestesiar profundamente o rato, desinfete ao redor da pata traseira direita com 70% de etanol.
    NOTA: Verifique a falta de resposta à estimulação de beliscar aplicada nos dedes traseiros ou cauda para confirmar o estado de anestesia profunda.
  6. Aplique uma pomada oftalmica nos olhos para evitar a secagem da córnea após a indução da anestesia.
  7. Mergulhe a pata traseira direita do rato profundamente anestesiado em água quente a 65 °C ± 0,5 °C para 3 s. Faça uma marca no tornozelo de cada rato antes de mergulhar a pata traseira em água quente para manter a consistência na área queimada.
  8. Após a indução de queimaduras, leve os ratos para uma gaiola limpa e coloque-os em uma almofada de aquecimento até que os animais se recuperem da anestesia.
    NOTA: O agente analgésico, acetaminofeno (200 mg/kg), foi administrado intraperitoneal uma vez por dia durante 7 dias a partir do dia da queimadura (Apenas Burn + Acetaminofeno grupo). O grupo Burn foi tratado com soro fisiológico como controle de veículos. O experimento foi realizado de acordo com o método descrito em um estudo anterior4.

2. Medição da aodínia mecânica

  1. Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e deixe-os aclimatar pelo menos por 30 minutos antes do teste. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização do teste.
  2. Coloque os ratos em uma caixa quadrada (diâmetro: 13 cm, altura: 12 cm) em um piso de malha metálica (tamanho de malha: 0,7 cm x 0,7 cm) e deixe-os aclimatar por pelo menos 30 min.
  3. Avalie o limiar mecânico da pata traseira utilizando o método de estímulo ascendente 19,20.
  4. Pique suavemente uma série de filamentos von Frey com intervalos de 5-8 s para estimular o plantar traseiro. Obtenha os valores da linha de base no dia anterior à indução da queimadura.
    NOTA: Os filamentos de 0,16-1,2 g von Frey foram utilizados no teste para medir o limiar de retirada da pata em todos os animais, respectivamente. O teste de resposta de retirada da pata foi iniciado com a menor força de dobra do filamento von Frey (0,16 g neste protocolo). Se não houve resposta, então um filamento com a próxima força de dobra foi aplicado.
  5. Realize cinco ensaios para avaliar limiares mecânicos para cada pata traseira ipsilateral (ferida).
    NOTA: A força de dobra do filamento von Frey que produz resposta mais de três vezes dos cinco ensaios em cada animal foi expressa como limiar de abstinência de patas (PWT, g). Os limiares mecânicos foram medidos um dia antes e em 1, 3, 5 e 7 dias após a lesão por queimadura. O efeito analgésico foi avaliado 1h após a administração do acetaminofeno no animal.

3. Análise automatizada da marcha

  1. Aclimime os camundongos no sistema de análise de marcha uma vez por dia durante 10-15 min a partir de 5 dias antes da lesão da queimadura. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a análise da marcha.
  2. No dia do teste, leve os ratos para a sala de testes comportamentais e aclimata-os por pelo menos 30 minutos antes do teste.
    NOTA: Realize testes de aclimatação e análise de marcha em um ambiente escuro. Defina as condições do menu do programa da seguinte forma.
    1. Depois de executar o programa, clique no menu Criar novos experimentos para designar a pasta para salvar os dados.
    2. Após a designação, defina o tempo máximo de execução para 5 s e variações máximas de velocidade permitidas para 50%.
    3. Selecione uma câmera registrada e defina o comprimento da passarela para 30 cm na guia Configuração do programa.
    4. Na guia Adquirir do menu do programa, selecione Aquisição Aberta.
    5. Com base nas mensagens de status, clique no botão "Snap Background" para adquirir uma imagem de fundo de uma passarela vazia.
  3. Clique no botão Iniciar aquisição e, em seguida, coloque o mouse na entrada da passarela transversível esquerda-direita. A gravação começará automaticamente após a livre circulação do mouse.
    NOTA: Se a marcha do animal tiver sido registrada com sucesso e todos os passos forem detectados, ele será marcado como Compatível Run com um ícone verde. Se o software não detectar nenhum passo, um ícone vermelho será exibido, nesse caso é recomendado realizar a gravação novamente. Os autores recomendam coletar e analisar pelo menos cinco corridas bem-sucedidas realizadas com velocidades de execução semelhantes.
  4. Na guia Adquirir do menu do programa, selecione Classificar corridas.
    NOTA: Depois de selecionar os dados obtidos a partir da execução de conformidade bem sucedida acima, vá para a tela de análise de vídeo onde os padrões de marcha dos ratos foram gravados.
  5. Selecione a execução a ser analisada e clique no botão Classificação automática .
  6. Depois de realizar a classificação automática, remova o nariz, o reconhecimento genital e o equívoco das patas para os dados de lixo em cada execução e, em seguida, analise os dados.
    NOTA: Todos os parâmetros estatísticos são automaticamente analisados e salvos no programa, e valores de dados brutos podem ser encontrados no menu de análise do experimentador. A análise automática da marcha foi realizada antes e aos 1, 3, 5 e 7 dias após lesão por queimadura. A avaliação foi realizada 30 min após a administração de acetaminofeno no grupo Burn + Acetaminofeno e 30 min após o tratamento salino no grupo Burn. Este experimento foi realizado de acordo com o método descrito nos estudos anteriores 4,21,22.

4. Medição do comportamento semelhante à depressão

NOTA: Comportamento baseado em desespero, tempo de imobilidade na água foi medido pelo teste de natação forçado.

  1. Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e aclimata-os por pelo menos 30 minutos antes do teste. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização do teste de natação forçado.
  2. Coloque o mouse em um cilindro de plexiglass claro (10 cm x 25 cm) contendo 15 cm de água (25 °C ± 0,5 °C) por 15 min.
  3. Depois de 24 horas, coloque o mouse no cilindro das mesmas condições e meça o tempo de imobilidade.
    NOTA: O tempo de imobilidade foi medido por 5 minutos de tempo de teste, e o tempo em que os ratos paravam de subir ou nadar e apenas flutuavam para manter a cabeça acima da superfície da água foi registrado. O teste de natação forçada foi realizado no dia 7 após a lesão por queimadura. A avaliação foi realizada 1 h após a administração de acetaminofeno no grupo Burn + Acetaminofeno, e 1h após o tratamento salino no grupo Burn. O experimento foi realizado de acordo com o método descrito em estudos anteriores23,24.

5. Medição da função motora normal

NOTA: O teste da haste rota foi realizado para diferenciar a função motora anormal após lesão por queimadura.

  1. Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e aclimata-os por pelo menos 30 minutos antes do teste. Use um vestido cirúrgico, luvas e máscara durante a realização do teste de natação forçado.
  2. Coloque os animais em uma plataforma cilíndrica rolando (5,7 cm de largura; 3 cm de diâmetro) suspensos 16 cm acima da parte inferior do aparelho.
  3. Permita que cada animal treine uma vez por dia em uma vara rota por pelo menos 5 dias antes da indução de queimaduras.
  4. Realize o teste rota-rod a cada 20 minutos por 2 h após a administração de drogas. Defina o tempo de corte para 2 minutos.
  5. Meça a duração do tempo que o mouse corre em uma haste giratória na velocidade constante de 15 rotações por minuto sem cair.
    NOTA: O teste de rota-has foi realizado 7 dias após a indução da lesão por queimadura. A avaliação foi realizada imediatamente após a administração de acetaminofeno no grupo Burn + Acetaminofeno e após o tratamento salino no grupo Burn. Alfaxalone foi usado como um controle positivo para drogas tratadas experimentalmente neste teste. Durante o teste rotarod, a duração do tempo que o mouse corre na haste giratória sem cair é medida. O experimento foi realizado de acordo com o método descrito em estudos anteriores22,25.

Resultados

Com o objetivo de minimizar o sofrimento animal e reduzir o número de animais utilizados pelas diretrizes de Três Rs (Substituição, Redução e Refinamento), este estudo foi desenhado com o número mínimo de animais para a coleta de dados significativos estabelecidos por meio de experimento preliminar. Neste estudo, os experimentos comportamentais foram realizados de forma independente duas vezes. Foram realizados os testes de comportamento semelhante à marcha, a aodínia mecânica e os ensaios comportamentais seme...

Discussão

A queimadura escaldante é um tipo de queimadura térmica causada por líquidos aquecidos. Foi sugerido que queimaduras de primeiro ou segundo grau ocorrem na maioria dos casos, mas o contato a longo prazo com fontes de calor pode causar queimaduras de terceiro grau26. No presente estudo, a lesão por queimadura foi induzida pela exposição da pata traseira direita dos camundongos em água quente a 65 °C por 3 s 4,26. Foram detectados da...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade Nacional de Chungnam e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (NRF-2019R1A6A3A01093963 e NRF-2021R1F1A1062509).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD307809
1.5 mL tubeAxygenMCT-150-C
50 mL tubeSPL50050
Acetaminophen BioXtra, ≥99.0%Sigma-AldrichA7085-100GThis analgesic agent is used as a positive control.
Alfaxan multidose (Alfaxalone)JUROX Pty.LimitedIn this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test.
CatWalk automated gait analysis systemNoldusCatWalk XTGait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction
OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment)Ashish Life ScienceThis material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia.
Plexiglass cylinderSCITECH KOREAcustom made productsUsed in forced swimming test
Rota-rod systemSCITECH KOREAAccelerating rota rodUsed in the measurement of Normal Motor Function
von Frey filamentsNorth Coast MedicalNC12775Used in the measurement of Mechanical Allodynia
WaterbathCHANGSHIN SCIENCEC-WBEUsed in the burn injury induction

Referências

  1. Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
  2. Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
  3. Montgomery, R. K. Pain management in burn injury. Critical Care Nursing Clinics of North America. 16 (1), 39-49 (2004).
  4. Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
  5. Abdi, S., Zhou, Y. Management of pain after burn injury. Current Opinion in Anaesthesiology. 15 (5), 563-567 (2002).
  6. Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
  7. Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
  8. Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
  9. Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
  10. Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
  11. Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
  12. Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
  13. Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
  14. Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
  15. Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
  16. Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
  17. Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
  18. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
  19. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  20. Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
  21. Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
  22. Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
  23. Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
  24. Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
  25. Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
  26. Mosby's. . Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), 36 (2006).
  27. Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  28. Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
  29. Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
  30. Yan, H. C., Cao, X. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  31. Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
  32. Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
  33. Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
  34. Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).

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