Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

Resumo

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Resumo

O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente até o advento da COVID-19. O Mtb evoluiu para persistir em seu ambiente intracelular, evadir as defesas do hospedeiro e desenvolveu resistência a muitas drogas antituberculares. Uma abordagem para resolver a resistência é identificar os medicamentos aprovados existentes que aumentarão a resposta imune do hospedeiro ao Mtb. Essas drogas poderiam então ser reaproveitadas como terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) para encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência aos antibióticos.

A quantificação do crescimento intracelular de Mtb em macrófagos é um aspecto crucial da avaliação do potencial HDT. O padrão-ouro para medir o crescimento de Mtb é a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Neste protocolo, um sistema de cultura automatizado, baseado em caldo, que é mais comumente usado para detectar Mtb em espécimes clínicos, foi adaptado para triagem pré-clínica de terapias direcionadas ao hospedeiro. Avaliou-se a capacidade do sistema de ensaio de cultura líquida para investigar o crescimento intracelular de Mtb em macrófagos tratados com HDT. Os HDTs testados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de Mtb foram ácido retinóico totalmente trans (AtRA), tanto em solução quanto encapsulado em micropartículas poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e a combinação de interferon-gama e linezolida. As vantagens desta técnica automatizada baseada em cultura líquida em relação ao método CFU incluem simplicidade de configuração, preparação menos trabalhosa e tempo mais rápido para os resultados (5-12 dias em comparação com 21 dias ou mais para placas de ágar).

Introdução

O Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da TB, foi o assassino de doenças infecciosas mais significativo globalmente em 2019¹. Para escapar das defesas do hospedeiro, o Mtb subverte a atividade micobactericida de células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas (DCs), permitindo que ele persista intracelularmente e se replique². A falta de uma vacina eficaz para prevenir a tuberculose pulmonar adulta e o crescente surgimento de cepas resistentes a medicamentos destacam a necessidade urgente de novas terapias.

As terapias adjuvantes dirigidas ao hospedeiro (HDT) podem encurtar o tempo de tratamento e ajudar a superar a resistência³. A avaliação pré-clínica de candidatos a HDT in vitro para determinar a atividade micobactericida dentro de macrófagos geralmente depende da quantificação do crescimento de Mtb por unidades formadoras de colônias (UFC) em placas de ágar sólido. Este é um ensaio lento, trabalhoso que não se presta a uma triagem rápida de drogas. Sistemas de detecção microbiana automatizados e baseados em caldo comercialmente disponíveis são mais comumente usados em laboratórios de microbiologia clínica para detecção e teste de suscetibilidade a medicamentos de Mtb e outras espécies micobacterianas em espécimes clínicos⁴. Esses instrumentos medem o crescimento indiretamente com base na atividade metabólica bacteriana que leva a mudanças físicas nos meios de cultura (mudança nos níveis ou pressão de CO₂ ou O₂) monitoradas ao longo do tempo⁵. A leitura é do tempo de positividade (TPP), que já demonstrou se correlacionar com a UFC de Mtb em espécimes de escarro de pacientes com TB em resposta ao tratamento ^6,7 e em lisados de pulmão e baço murinos infectados⁸. Além disso, sistemas de detecção de cultura líquida têm sido utilizados para medir o efeito de terapias convencionais dirigidas a patógenos sobre o crescimento de micobactérias em cultura axênica e macrófagos cultivados ^9,10. O instrumento também tem sido utilizado para investigar a capacidade inata de células dendríticas e de macrófagos alveolares para controlar o crescimento intracelular de Mtb^11,12. Este protocolo experimental demonstra que um sistema de diagnóstico de cultura líquida pode ser adaptado para realizar triagem pré-clínica de HDT para TB em macrófagos cultivados. Em comparação com a enumeração da UFC, a principal vantagem desta técnica é que reduz consideravelmente o trabalho experimental e o tempo necessário para quantificar o crescimento/sobrevivência das micobactérias intracelulares. Esta técnica baseia-se no acesso a um instrumento de cultura automatizado que pode ser usado para avaliar a sobrevivência micobacteriana intracelular em células imunes tratadas com uma ampla gama de reagentes farmacológicos visando as funções celulares para aumentar a imunidade do hospedeiro.

Protocolo

Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados utilizando a cepa H37Ra atenuada de Mtb, que pode ser manuseada em laboratório de Nível de Contenção 2. Todas as manipulações de micobactérias vivas foram realizadas em gabinete de segurança biológica (BSC) Classe II. Procedimentos experimentais foram projetados para minimizar a geração de aerossóis. A cultura de células eucarióticas (células THP-1) também foi realizada em um BSC Classe II. O laboratório realizou uma avaliação de risco e garantiu que todos os procedimentos fossem realizados de acordo com os regulamentos institucionais e nacionais de segurança biológica. A linhagem celular monocítica humana THP-1 foi utilizada para a realização do método descrito (etapa 1). As células são diferenciadas em macrófagos após estimulação com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA) antes da infecção por micobactérias.

1. Cultura celular

1. Propagar o estoque de sementes de H37Ra para a fase logarítmica em caldo de Middlebrook 7H9 (MB) suplementado com enriquecimento de albumina-dextrose-catalase (ADC) (10%) e polissorbato 80% a 0,05%. Conservar o stock de H37Ra em alíquotas de 1 ml num congelador de -80 °C durante um período máximo de 1 ano.
2. Descongele um frasco para injetáveis de 1 ml de Mtb-H37Ra e transfira-o para um balão de T25 com uma tampa de filtro contendo 9 ml de caldo suplementado MB aproximadamente 1 semana antes da experiência planeada. Incubar a 37 °C durante 5-7 dias numa incubadora estática.
3. Cultivar células THP-1 em RPMI-1640 suplementadas com soro fetal de bezerro a 10% não morto por calor (c)RPMI) em um frasco de T75 em uma incubadora umidificado de CO 2 a 5% de CO₂/37 °C e subcultura duas vezes por semana para manter uma densidade inferior a 1 x 10⁶ células/mL.
4. Diferenciar as células THP-1 em macrófagos 3 dias antes da infecção, pipetando suavemente as células várias vezes usando uma pipeta sorológica em frascos T75 para dispersar quaisquer aglomerados e colocá-los em um tubo cônico de 50 mL.
5. Centrifugar células a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente, decantar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet em 2 ml de RPMI. Realize a contagem de células para estimar células/mL.
6. Sementes de 2 mL de macrófagos THP-1 em placas de cultura de tecidos de 12 poços a uma densidade de 100.000 células/mL em cRPMI com 100 ng/mL de PMA por 72 h. Remova o meio contendo PMA das células e reabasteça com cRPMI fresco antes da infecção por Mtb.
7. Configure placas individuais para cada ponto de tempo necessário.
8. Células de sementes na mesma densidade (100.000 células/mL) em lâminas de câmara de vidro de 2 poços para determinar a multiplicidade de infecção (MOI).
9. Colocar numa incubadora humidificada a 5% de CO₂ durante 3 dias a 37 °C.

2. Quantificação da absorção de Mtb

1. Determinação da captação de Mtb por macrófagos (MOI)
   1. Configure o gabinete de segurança biológica (BSC) de Classe II no dia da infecção e trabalhe em duas camadas de papel tissue para capturar quaisquer derramamentos. Configure recipientes de descarte de resíduos de acordo com os regulamentos locais.
   2. Remover 6-8 mL de cultura micobacteriana do frasco de T25 e transferi-lo para um tubo de polipropileno de 15 mL.
      NOTA: Tubos de menor volume podem ser usados para experimentos menores.
   3. Centrifugar o tubo numa centrífuga de bancada à temperatura ambiente durante 10 min a 2890 x g.
   4. Retire cuidadosamente o tubo da centrífuga e transfira-o para o gabinete de segurança biológica. Aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.
      1. Despeje o sobrenadante no recipiente de descarte do desinfetante, reencape o tubo e ressuspenda as bactérias no meio restante, tocando no lado do tubo. Aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.
   5. Adicione 2 mL de cRPMI pré-aquecido, misture suavemente e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
   6. Ressuspeite as micobactérias com muito cuidado usando uma agulha de 25 G e uma seringa de 5 mL. Para ressuspender, retire a suspensão de micobactérias para a seringa e ejete muito suavemente pela parede lateral do tubo para minimizar a produção de aerossóis. Repita 6-8 vezes.
      NOTA: Tenha o máximo de cautela, pois esta é uma cultura de alta densidade de micobactérias. Para evitar o risco de lesão por picada de agulha, use agulhas contundentes sempre que possível e seringas de bloqueio Luer.
   7. Eliminar a agulha e a seringa num recipiente para objetos cortantes no BSC.
   8. Transfira a suspensão para um tubo de microfuga de 2 mL (com tampa rosqueada) e centrifugar à temperatura ambiente por 3 min a 100 x g para pellet quaisquer aglomerados restantes. Devolva o tubo ao armário de segurança e aguarde 1 min para permitir que as bactérias se instalem.
   9. Transfira o 1-1,5 mL superior do sobrenadante para um novo tubo. Rejeitar o tubo original no balde de resíduos que contém desinfectante. Misture bem e adicione várias quantidades da suspensão micobacteriana (por exemplo, 5, 25, 50, 150 μL) às lâminas da câmara de vidro de 2 poços e incube por 3 h em uma incubadora de CO₂ a 37 °C.
2. Coloração para bactérias ácidas resistentes (BAAR)
   NOTA: Após 3 h de incubação, os macrófagos são lavados e fixados com paraformaldeído para inativar micobactérias. As lâminas são então coradas usando um kit de Auramina O Modificada (ver Tabela de Materiais) para estimar micobactérias fagocitadas por célula. Devido à sua parede celular cerosa, as micobactérias retêm o corante Auramina após uma lavagem ácido-alcoólica. Os núcleos dos macrófagos são então contra-corados com Hoechst. Este método permite que o número de bactérias fagocitadas por célula seja contado e é usado para determinar a multiplicidade de infecção (MOI) dos macrófagos.
   1. Remova o meio da lâmina da câmara de vidro depois de pipetar para cima e para baixo três vezes para desalojar as bactérias que não foram fagocitadas.
   2. Lave uma vez com 2 mL de PBS à temperatura ambiente.
   3. Armazenar existências de paraformaldeído a 4%, dissolvido em PBS em alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses. Descongele uma alíquota de 4% de paraformaldeído imediatamente antes do uso. Diluir a 2% de paraformaldeído com PBS e adicionar 2 mL por poço.
   4. Incubar por 10 min à temperatura ambiente. A lâmina da câmara de vidro pode ser removida do gabinete de segurança nesta fase para manchas.
   5. Lave o escorregador sob um fluxo suave de água da torneira.
   6. Dispense Auramina suficiente na lâmina para cobrir as células usando uma pipeta de transferência de plástico e incube por 1 min à temperatura ambiente no escuro (cubra com papel alumínio).
   7. Lave o excesso de corante da lâmina com água da torneira e adicione o descolorante / quencher por 1 min no escuro.
   8. Lavar o excesso com água da torneira e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente com Hoechst 33342 (10 μg/ml em PBS) no escuro.
   9. Lave a mancha Hoechst com água da torneira, remova as câmaras, escorra o excesso de água da lâmina, adicione uma gota de antifade e coverslip e seque ao ar.
   10. Examine a lâmina sob o microscópio fluorescente usando a objetiva de óleo de 100x. As micobactérias fluorescem em verde sob o filtro FITC. Os núcleos fluorescem em azul sob o filtro DAPI (Figura 1C).
   11. Determine o MOI contando o número de micobactérias fagocitadas por célula e a porcentagem de células infectadas.
   12. Calcular o volume de suspensão de micobactérias necessário para atingir o MOI necessário com base na área de superfície de um poço na placa; por exemplo, a área de superfície das lâminas da câmara de vidro utilizadas neste experimento é de 4 cm². MOI baixo (aproximadamente 1-2 bacilos/célula) é desejável para experimentos conduzidos ao longo de vários dias (por exemplo, 5 dias).
3. Infecção de macrófagos
   1. Misture bem a suspensão de micobactérias e adicione a quantidade necessária às células em placas de 12 poços uma vez que o volume necessário para atingir o MOI desejado tenha sido determinado.
   2. Incubar a 37 °C durante 3 h para permitir que as micobactérias sejam fagocitadas.
   3. Remova as bactérias extracelulares lavando os poços com RPMI ou HBSS quentes várias vezes.
   4. Lisar os macrófagos em um poço (amostra de 3 h) para determinar o tempo percentual até a positividade (PTT) do inóculo inicial (amostra de 3 h), conforme descrito na etapa 3 abaixo.
   5. Adicione cRPMI fresco e as doses de drogas necessárias ou controle do veículo aos poços restantes, incubar as placas na incubadora de CO₂ a 37 °C pelo tempo necessário (dependendo do projeto experimental, mas geralmente em vários intervalos entre 1 a 8 dias).

3. Colheita de amostras para o sistema de detecção de cultura líquida

NOTA: No dia da infecção, as micobactérias extracelulares são removidas por lavagem e as micobactérias intracelulares são colhidas por lise de um poço de macrófagos (amostra de 3 h) para determinar a quantidade inicial fagocitada como controle basal da infecção. Em momentos subsequentes, tanto o meio, o lisado celular e as lavagens são combinados para medir o crescimento micobacteriano total. O crescimento extracelular e intracelular também pode ser avaliado separadamente, se desejado.

1. Colheita de 3 h de amostra para determinação de PTT
   1. Lavar as micobactérias extracelulares de todos os poços após as 3 h iniciais de infecção, conforme descrito na etapa 2.3.3. Adicionar 1 mL de meio fresco ao poço de controle de 3 h para equalizar o volume de lisado com os de momentos posteriores.
      NOTA: Ver passo 3.2.7 se as micobactérias extracelulares devem ser excluídas da análise.
2. Coleta de amostras
   1. Caldo MB quente e garrafas de cultura de instrumentos para trazê-los à temperatura ambiente.
   2. Transfira o meio da placa de 12 poços para os tubos cônicos rotulados correspondentes.
   3. Adicione 500 μL de tampão de lise estéril (0,1% Triton x-100 em PBS filtrado através de um filtro estéril de 0,2 μm) a cada poço por 10 min.
   4. Raspe suavemente as células do poço com um raspador estéril e combine com o meio no tubo cônico apropriado.
   5. Lave o poço com 0,5 mL de PBS estéril e transfira para o tubo apropriado.
   6. Passe suavemente cada amostra através de uma agulha e seringa (25 G) 6-8 vezes para quebrar os aglomerados. Diluir as amostras 1:10 em caldo MB; Amostra de 100 μL + meio de 900 μL MB.
   7. Nos horários/dias necessários (geralmente entre 1 a 8 dias), colha as amostras restantes seguindo as etapas 3.2.1-3.2.6 acima.
      NOTA: Os investigadores podem preferir excluir micobactérias extracelulares de sua análise, caso em que, na etapa 3.2.2 acima, o meio de cada poço é descartado e os macrófagos são lavados várias vezes antes de adicionar tampão de lise.
3. Inoculação e carregamento de frascos de cultura de instrumentos
   NOTA: Os detalhes do instrumento de cultura líquida e dos consumíveis relacionados são fornecidos na Tabela de Materiais.
   1. Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar.
      NOTA: Esta etapa precisa ser executada no BSC.
   2. Prepare frascos transferindo suplementos nutricionais suficientes para todas as amostras em um tubo cônico (0,5 mL / frasco). Use uma agulha e seringa para injetar 0,5 mL de suplemento nutritivo no frasco de cultura do instrumento.
   3. Pipetar 500 μL da amostra diluída (1:10) para um tubo com fundo em V de 1 ml.
   4. Use uma agulha e seringa para injetar os 500 μL de amostra no frasco de cultura do instrumento atribuído.
   5. Esterilize a tampa de borracha do frasco de cultura do instrumento com papel de seda embebido em álcool a 70% e deixe-a secar ao ar. Limpe os frascos com papel de seda embebido em álcool a 70% antes de sair do BSC.
   6. Transporte cuidadosamente as garrafas do armário de biossegurança para o instrumento de carregamento.
   7. Pressione o botão de carregamento no sistema automatizado de detecção microbiana.
   8. Digitalize os códigos de barras nos frascos de cultura de instrumentos e coloque os frascos na incubadora do sistema de detecção a 37 °C por até 42 dias. Leia e registre o tempo necessário para alcançar a positividade a partir da tela do instrumento.
      NOTA: O código de barras permite que o instrumento identifique a garrafa e vincule as leituras de refletância com uma garrafa específica.
   9. Calcular o tempo percentual até a positividade (PTT) comparando o PTT do inóculo intracelular inicial (Dia 0) com o dos macrófagos cultivados para os tempos indicados. Uma mudança positiva na porcentagem de PTT significa crescimento^{micobacteriano 13}.
      Por exemplo, para o dia 3:
      Variação percentual no tempo para positividade =

Resultados

O instrumento automatizado de cultura de líquidos utilizado neste estudo monitora os níveis de CO₂ a cada 10 min. Uma mudança de cor no sensor na parte inferior do frasco do instrumento é medida colorimetricamente e expressa como unidades de reflectância. O software do instrumento então aplica algoritmos de detecção para calcular o tempo de positividade (TTP), ou seja, o número de dias desde a inoculação até que as culturas sejam sinalizadas como positivas (Figura 1A)....

Discussão

Os autores utilizaram o método de cultura líquida descrito neste protocolo para monitorar o crescimento de Mtb em macrófagos derivados de monócitos e macrófagos alveolares e células THP-1 diferenciadas com PMA 11,16,17. Essa técnica também pode ser modificada para uso com células não aderentes¹². Mais recentemente, o instrumento também foi utilizado em estudos pré-clínicos para avaliar o áci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IX51 Fluorescent Microscope	Olympus, Japan	N/A	AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	62.547.254	Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement	Biomerieux ( Hampshire, UK)	414997	Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles	Biomerieux ( Hampshire, UK)	419744	Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm	Corning Incorporated, Germany	431219	Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	Macrophage cell culture
Glycerol, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	Nuclear stain
IFNγ, recombinant human	R&D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	Colony Forming Units
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	156367	Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line	ATCC, Virginia, USA	ATCC TIB-202	Macrophage cell culture