Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Resumo

Apesar dos recentes avanços na caracterização do proteome mitocondrial da levedura, a localização subocondrial de um número significativo de proteínas permanece indescritível. Aqui, descrevemos um método robusto e eficaz para determinar a localização suborganellar das proteínas mitocondriais de levedura, que é considerada um passo fundamental durante a elucidação da função proteica mitocondrial. Este método envolve uma etapa inicial que consiste em obter mitocôndrias intactas altamente puras. Essas preparações mitocondriais são então submetidas a um protocolo de subfração composto por choque hipotônico (inchaço) e incubação com proteinase K (protease). Durante o inchaço, a membrana mitocondrial externa é seletivamente interrompida, permitindo que a proteinase K digerir proteínas do compartimento espacial intermembrano. Paralelamente, para obter informações sobre a topologia das proteínas da membrana, as preparações mitocondriais são inicialmente sônicas e, em seguida, submetidas à extração alcalina com carbonato de sódio. Finalmente, após a centrifugação, as frações de pelotas e supernasces desses diferentes tratamentos são analisadas por SDS-PAGE e mancha ocidental. A localização subocondrial, bem como a topologia da membrana da proteína de interesse, são obtidas comparando seu perfil de mancha ocidental com padrões conhecidos.

Introdução

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas que desempenham papéis cruciais em bioenergésicos, metabolismo celular e caminhos de ^{sinalização1}. Para executar adequadamente essas tarefas, as mitocôndrias contam com um conjunto único de proteínas e lipídios responsáveis por sua estrutura e função. O fermento saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizado como um sistema modelo para investigações sobre processos mitocondriais, bem como para outras organelas2. Os códigos do genoma mitocondrial para apenas oito proteínas na levedura; a grande maioria das proteínas mitocondriais (~99%) são cod....

Protocolo

1. Crescimento de células de levedura

1. Isole colônias únicas da tensão de interesse, espalhando uma pequena porção das células de um estoque de glicerol de -80 °C em um YPD (extrato de levedura de 1%, 2% peptone, 2% glicose) placa de ágar. Incubar a placa a 30 °C durante 2-3 dias.
   NOTA: A cepa S. cerevisiae utilizada neste protocolo é derivada de BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Com exceção dos genes marcadores auxotróficos, esta cepa não contém nenhum gene excluído e não carrega nenhum plasmídeo. Assim, pode ser cultivada com sucesso em um meio rico, e....

Resultados

O sucesso do protocolo de fracionamento subocondrial depende da obtenção de mitocôndrias intactas altamente purificadas. Para isso, é essencial que durante a lise celular da levedura, a intactidade das organelas permaneça quase totalmente preservada. Isso é conseguido usando um protocolo de lise celular que combina a digestão enzimática da parede celular seguida pela interrupção física da membrana plasmática usando um homogeneizador do Dounce. Os conteúdos mitocondriais são então coletados por centrifugaç.......

Discussão

O protocolo aqui apresentado tem sido utilizado com sucesso e continuamente otimizado por um longo tempo para determinar a localização da proteína nos compartimentos subocondriais13,14,18,21,22,23. A confiabilidade e a reprodutibilidade deste protocolo dependem fortemente da pureza e integridade das preparações mitocondr.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast