De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células

Resumo

Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.

Resumo

A síntese de proteínas sem células (CFPS) cresceu como uma plataforma de biotecnologia que captura a transcrição e a máquina de tradução in vitro. Inúmeros desenvolvimentos tornaram a plataforma CFPS mais acessível aos novos usuários e expandiram a gama de aplicativos. Para sistemas cfps baseados em lysate, extratos celulares podem ser gerados a partir de uma variedade de organismos, aproveitando a bioquímica única desse hospedeiro para aumentar a síntese proteica. Nos últimos 20 anos, escherichia coli (E. coli) tornou-se um dos organismos mais utilizados para apoiar cfps devido à sua acessibilidade e versatilidade. Apesar de inúmeros avanços importantes, o fluxo de trabalho para a preparação do extrato de células E. coli tem permanecido um gargalo fundamental para que novos usuários implementem CFPS para suas aplicações. O fluxo de trabalho de preparação do extrato é demorado e requer conhecimento técnico para alcançar resultados reprodutíveis. Para superar essas barreiras, relatamos anteriormente o desenvolvimento de um fluxo de trabalho de autoindução livre de células 24 horas (CFAI) que reduz a entrada do usuário e a experiência técnica necessária. O fluxo de trabalho do CFAI minimiza a habilidade laboral e técnica necessária para gerar extratos celulares, ao mesmo tempo em que aumenta as quantidades totais de extratos celulares obtidos. Aqui descrevemos esse fluxo de trabalho de forma passo a passo para melhorar o acesso e apoiar a ampla implementação do CFPS baseado em E. coli .

Introdução

O uso de síntese de proteínas livres de células (CFPS) para aplicações de biotecnologia cresceu substancialmente nos últimos anos ^1,2,3. Esse desenvolvimento pode ser atribuído, em parte, ao aumento dos esforços na compreensão dos processos que ocorrem no CFPS e ao papel de cada componente ^4,5. Além disso, os custos reduzidos atribuídos a configurações otimizadas e fontes alternativas de energia tornaram a tecnologia livre de células mais fácil de implementar para novos usuários 6,7,8,9. Para implementar os fatores necessários de transcrição e tradução para a síntese proteica, o extrato celular é frequentemente usado para conduzir reações livres de células¹⁰. Os guias de usuários publicados recentemente forneceram protocolos simples para a produção de extrato funcional, facilitando a implementação de usuários novos e experientes^{, tanto} 1,11,12,13,14. O extrato celular é geralmente obtido através da lise de uma cultura celular, que pode ser cultivada usando diferentes organismos dependendo do uso específico desejado ^1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) tornou-se rapidamente um dos organismos hospedeiros mais utilizados para a produção de extratos funcionais¹⁷. A cepa BL21 Star (DE3) é preferida porque remove as proteases da membrana externa (OmpT protease) e do citoplasma (Lon protease), proporcionando um ambiente ideal para a expressão proteica recombinante. Além disso, o DE3 contém o λDE3 que carrega o gene para a polimerase T7 RNA (T7 RNAP) sob o controle do promotor lacUV5; o componente estelar contém um gene RNaseE mutado que previne o decote de mRNA 4,14,18,19. Sob o promotor lacUV5, a indução isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) permite a expressão de T7 RNAP^20,21. Essas cepas são usadas para cultivar e colher células, que dão matéria-prima para preparação de extratos. A lise celular pode ser realizada usando uma variedade de métodos, incluindo batida de contas, prensa francesa, homogeneização, sônica e cavitação de nitrogênio 1,11,12,22.

O processo de cultura bacteriana e colheita é consistente na maioria das plataformas ao usar E. coli, mas requer vários dias e intensa supervisão de pesquisadores ^1,11,13. Este processo geralmente começa com uma cultura de sementes durante a noite no caldo LB, que após o crescimento da noite para o dia é então inoculado em uma cultura maior de 2xYTPG (levedura, triptona, tampão de fosfato, glicose) no dia seguinte. O crescimento dessa cultura maior é monitorado até chegar à fase de troncos do início ao meio, a uma densidade óptica (OD) de 2,5^14,20. A medição constante é necessária, pois os componentes da transcrição e da tradução foram previamente demonstrados como altamente ativos na fase^{de log 23,24} do início ao meio. Embora esse processo possa criar extrato reprodutível, nosso laboratório desenvolveu recentemente um novo método usando a Mídia de Autoindução Livre de Células (CFAI), que reduz a supervisão dos pesquisadores, aumenta o rendimento global do extrato para um determinado litro de cultura celular e melhora o acesso à preparação de extratos baseados em E. coli para usuários experientes e novos (Figura 1 ). Aqui fornecemos o guia passo-a-passo para implementar o fluxo de trabalho DO CFAI, para passar de uma placa de células listradas para uma reação CFPS completa dentro de 24 horas.

Protocolo

1. Crescimento da mídia

1. Prepare 960 mL de mídia CFAI conforme descrito na Tabela 1 e ajuste o pH para 7.2 usando KOH.
2. Transfira a mídia cultural para um frasco de 2,5 L e autoclave por 30 min a 121 °C.
3. Prepare uma solução de açúcar de 40 mL conforme descrito na Tabela 1. Esterilize a solução em um recipiente de vidro autoclavado separado.
   NOTA: A solução de açúcar pode ser armazenada em uma incubadora de 30 °C até que seja usada.
4. Deixe a mídia esfriar completamente a menos de 40 °C após a autoclavagem.
5. Antes da inoculação dos meios de comunicação CFAI, adicione a solução de açúcar diretamente à mídia CFAI.
6. Para inocular a mídia, deslize um loopful de colônias de uma placa E. coli BL21 Star (DE3) anteriormente listrada e insira diretamente na mídia. Gire o laço na mídia, mas evite tocar nas laterais do recipiente. Certifique-se de que a placa de raia está fresca, com células viáveis.
7. Coloque o frasco com a mídia inoculada em uma incubadora de 30 °C enquanto treme a 200 rpm. Permita que a cultura cresça da noite para o dia. Se as células forem inoculadas à noite, a cultura atingirá uma densidade óptica aproximada, medida a 600 nm (OD₆₀₀), de 10 na manhã seguinte. Os tempos de inoculação e colheita podem ser ajustados conforme necessário.

2. Colheita celular

1. Prepare o buffer S30 com antecedência e mantenha-o frio. Prepare o buffer S30 de acordo com a Tabela 2, para um pH final de 8.2.
   NOTA: O tampão S30 pode ser preparado dias antes da colheita da célula. Se isso for feito, prepare-se sem dithiothreitol e armazene a 4 °C. Adicione dithiothreitol pouco antes de usar.
2. A partir deste ponto, mantenha todas as soluções e materiais no gelo. Transfira 1 L de mídia para uma garrafa de centrífugas de 1 L e centrífuga a 5.000 x g entre 4-10 °C por 10 min. Decantar e se livrar do supernatante. Usando uma espátula estéril, transfira a pelota para um tubo cônico pré-refrigerado e anteriormente pesado 50 mL.
3. Lave uma vez com 30-40 mL de tampão S30 frio, reutilizando a pelota através de vórtice em rajadas de 30 s com períodos de descanso no gelo.
   NOTA: Devido a um maior volume de pelotas, dividir a pelota celular em dois tubos cônicos de 50 mL pode ser útil para a etapa de lavagem. Armazenar células em alíquotas menores também proporciona flexibilidade para o processamento a jusante.
4. Centrifugar a resuspensão celular a 5000 x g entre 4-10 °C por 10 min.
5. Descarte o supernatante e limpe qualquer excesso das paredes internas do tubo cônico de 50 mL usando um tecido limpo, evite tocar a própria pelota. Pesar e piscar congelam a pelota em nitrogênio líquido. Armazene a -80 °C até que use mais.
   NOTA: As pelotas podem não exigir o congelamento de flash se o usuário planeja continuar com o protocolo de preparação do extrato.

3. Preparação do extrato

1. Combine a pelota congelada com 1 mL de tampão S30 para cada 1 g da pelota celular e deixe descongelar no gelo por aproximadamente 30-60 min. Resuspend degelo de pelota através de vórtice em rajadas de 30 s com períodos de descanso no gelo. Vórtice até que não haja aglomerados visíveis de células restantes.
   NOTA: Aglomerados menores podem ser resuspended misturando-se usando uma pipeta.
2. Transfira alíquotas de 1,4 mL de ressuspensão celular em tubos de microfuge de 1,5 mL para lise celular. Sonicate cada tubo com uma frequência de 20 kHz e 50% de amplitude para três rajadas de 45 s com 59 s de descanso por ciclo cercado por um banho de gelo. Inverta o tubo entre os ciclos e adicione imediatamente 4,5 μL de 1 M de dithiothiothreitol após o último ciclo de sônica.
   NOTA: Devido ao calor liberado da sônica, é extremamente importante garantir que todas as alíquotas sejam mantidas no gelo quando não forem sônicas. O banho de gelo deve ser constantemente reabastecido ou grande o suficiente para ficar frio durante todo o processo de sônicação.
3. Centrifugar cada tubo a 18.000 x g e 4 °C por 10 min. Recupere o supernatante e aliquot em tubos de microfuça de 1,5 mL em alíquotas de 600 μL. O flash congela as alíquotas e armazena a -80 °C até que seja mais útil. Deve-se tomar cuidado para pipeta apenas o supernante.

4. Síntese de proteínas sem células

1. Descongele uma alíquota de extrato da etapa anterior para realizar 15 μL de reações de síntese proteica livre de células em tubos de microfuça de 1,5 mL em quadruplicato.
2. Prepare cada reação combinando 240 ng de DNA (concentração final de 16 μg/mL), 2,20 μL de Solução A, 2,10 μL da Solução B, 5,0 μL de extrato e um volume variado de água de grau molecular para preencher a reação a 15 μL. Essa reação pode ser dimensionada para volumes maiores. Consulte a Tabela 3 para proporções.
   1. Prepare a solução A e B de acordo com a Tabela 4. Cada solução pode ser preparada em lotes de 100 μL a 1 mL, aliquoted e armazenados a -80 °C até uso adicional.
      NOTA: A quantidade de DNA pode variar dependendo da proteína de interesse. Neste caso, o plasmídeo utilizado, pJL1-sfGFP, foi otimizado para realizar a 16 μg/mL, ou 597 μM.
3. Deixe as reações correrem pelo menos 4h a 37 °C.

5. Quantificação da proteína repórter, super pasta proteína fluorescente verde (sfGFP)

1. Utilizando uma placa de poliestireno preto de meia área de 96-bem, combine 2 μL de cada produto de reação de síntese proteica livre de células com 48 μL de 0,05 M hepes tampão no pH 7.2. Recomenda-se três a quatro réplicas de cada tubo de reação.
2. Quantifique a intensidade de fluorescência do sfGFP com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm.
3. Para a conversão de unidades relativas de fluorescência para rendimento volumoso (μg/mL) de sfGFP, estabeleça uma curva padrão utilizando pJL1-sfGFP purificado.

Resultados

Ao preparar a mídia CFAI, a glicose foi trocada por um aumento da lactose e glicerol como o principal substrato energético na mídia. Além disso, a capacidade de tampão da mídia CFAI também foi aumentada. Estes componentes específicos são dados na Tabela 1.

As células foram então cultivadas para um OD₆₀₀ de 10 e o padrão 2.5 em mídia CFAI para mostrar consistência com a qualidade do extrato, apesar das diferentes quantidades de extrato. A mídia 2.5 OD<...

Discussão

A supervisão dos pesquisadores é tradicionalmente necessária para duas ações-chave durante o crescimento celular: a indução de T7 RNAP e a colheita de células em um OD₆₀₀ específico. O CFAI evita ambos os requisitos para diminuir o tempo e o treinamento técnico do pesquisador necessários para preparar extratos celulares de alta qualidade. A autoindução do T7 RNAP é obtida substituindo a glicose por lactose como o açúcar primário na mídia, evitando a necessidade anterior de monitorar ativament...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microfuge Tubes	Phenix	MPC-425Q
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Biotek	BTCYT5F
D-Glucose	Fisher	D16-3
D-Lactose	Alfa Aesar	J66376
DTT	ThermoFisher	15508013
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
Glycerol	Fisher	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
HEPES	ThermoFisher	11344041
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G1501-500G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Luria Broth	ThermoFisher	12795027
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
NaCl	Alfa Aesar	A12313
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
NH4(Glu)	Sigma-Aldrich	09689-250G
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic	Acros, Organics	A0382124
Potassium Phosphate Monobasic	Acros, Organics	A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50HZ
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013