DUCT: Fundição de Resina Dupla seguida de Tomografia Microcomputada para Análise hepática 3D

Resumo

A tomografia microcomputada de fundição dupla de resina, ou DUCT, permite a visualização, digitalização e segmentação de dois sistemas tubulares simultaneamente para facilitar a análise 3D da arquitetura de órgãos. O DUCT combina a injeção ex vivo de duas resinas radiopacas seguidas de tomografia microcomputada e segmentação dos dados tomográficos.

Resumo

O fígado é o maior órgão interno em humanos e camundongos, e a alta fluorescência automática apresenta um desafio significativo para avaliar a arquitetura tridimensional (3D) do órgão no nível de todo o órgão. A arquitetura hepática é caracterizada por múltiplas estruturas lúmenizadas ramificadas, que podem ser preenchidas com resina, incluindo árvores vasculares e bilares, estabelecendo um padrão altamente estereotipado no parenchyma rico em hepatocitos. Este protocolo descreve o pipeline para a realização de tomografia microcomputada de fundição de resina dupla, ou "DUCT". O DUCT implica injetar a veia do portal e o ducto biliar comum com duas resinas sintéticas radiopacas diferentes, seguidas pela fixação tecidual. O controle de qualidade limpando um lobo, ou todo o fígado, com um agente de compensação óptica, permite a pré-triagem de amostras injetadas adequadamente. Na segunda parte do duto duct, um lobo ou todo o fígado pode ser usado para tomografia microcomputante (microCT) microCT, (segmentação semi-)automatizada e renderização 3D das redes venosas e biliares do portal. O MicroCT resulta em dados de coordenadas 3D para as duas resinas permitindo a análise qualitativa e quantitativa dos dois sistemas e sua relação espacial. O DUCT pode ser aplicado ao fígado de camundongos pós-natal e adulto e pode ser ainda mais estendido para outras redes tubulares, por exemplo, redes vasculares e vias aéreas nos pulmões.

Introdução

Fundição de resina de órgãos é uma técnica que remonta ^{ao século XVII1}. Um dos primeiros exemplos de fundição moderna de resina foi realizado no fígado humano a partir de uma autópsia. Os dutos biliares intrahápticos foram preenchidos com um agente de contraste misturado com gelatina, seguido por imagem com tomografia computadorizada de raio-x2. O objetivo da técnica DUCT é visualizar, digitalizar e analisar duas redes tubulares lançadas com resina, em conjunto, em 3D.

O DUCT baseia-se no amplo conhecimento existente de resina hepática de sistema único^, fundindo 3,4,5,6,7,8 e se estende à visualização e análise 3D simultâneas de dois ^sistemas9. O DUTO avançou o fundição de resina única para o fundição de resina dupla, misturando duas resinas radiopacas de contraste diferente e injetando essas resinas em duas redes diferentes, especificamente o ducto biliar comum e a veia portal. O DUCT pode ser aplicado a camundongos pós-natais jovens com resultados reprodutíveis já no pós-natal 15 (P15). Em comparação com as técnicas de imagem baseadas em microscopia, a principal vantagem é que o DUCT é mais rápido, livre de anticorpos e a autofluorescência do tecido hepático não interfere na imagem. Além disso, o DUCT fornece dados quantitativos descrevendo o estado de lumenização, diâmetro interno, conectividade de rede e perfusão. Diferenciar entre a presença de células formadoras de lúmen e sua morfogênese de fato em tubos é essencial para analisar órgãos nos quais as células ductulares estão presentes, mas não formam tubos, como pode ser o caso da síndrome de ^Alagille10. A principal desvantagem do DUCT é a penetração limitada da resina, que é viscosa e não entra em tubos de pequeno calibre (<5 μm). O DUCT PODE ser aplicado para qualquer estrutura tubular após determinar o ponto de entrada da injeção, como os sistemas circulatórios arterial e venoso, as vias aéreas, o ducto biliar extrahático ou vasos linfáticos. Poderia, assim, facilitar a análise completa da arquitetura de órgãos de outros tecidos, como pulmões e pâncreas.

As imagens segmentadas de MicroCT podem ser processadas usando software de imagem disponível comercialmente, como ImageJ, ou pipelines personalizados (por exemplo, MATLAB). O fígado injetado em resina pode ser analisado qualitativamente para expansão e conectividade de rede ou quantitativamente para volume, comprimento, ramificação, tortuosidade de um único sistema e a interação entre dois sistemas, como a distância entre dois sistemas ou dependência de galhos (o sistema 1 se ramifica próximo à ramificação do sistema 2?). O pipeline duct que engloba injeção de resina, digitalização de microCT e segmentação de dados de TC, combinado com análise quantitativa detalhada de mecanismos arquitetônicos de dois sistemas tubulares, poderia fornecer um padrão para análise hepática completa em modelos animais.

Protocolo

O protocolo descrito neste estudo foi aprovado e segue as regras e regulamentos de bem-estar animal do Estocolmo Norra Djurförsöksetiska nämnd (Conselho de Ética em Pesquisa animal de Estocolmo). Os animais utilizados neste estudo foram camundongos mutantes jag1H268Q em um fundo C3H/N e C57bl6J misto. Tanto o sexo masculino quanto o feminino foram incluídos no estudo. Os animais foram utilizados no pós-natal 15 ou como adultos entre 3 e 8 meses.

1. Injeções duplas de resina

1. Preparação
   1. Prepare a solução de resina. Para injeções duplas de resina do sistema, prepare as resinas amarelas e verdes, conforme descrito nas etapas 1.1.2-1.1.4.
   2. Prepare 1 mL de resina diluída por mouse.
   3. Resina Amarela: Diluir a borracha de silicone amarela (alta radiopacidade) com o diluído claro em uma diluição 3:1 para preparar a resina amarela para injeção.
   4. Resina Verde: Misture a borracha de silicone azul (radiopacidade indetectável) com o diluente claro em uma diluição 1:1 para preparar a resina azul. Para gerar resina verde, misture a resina azul diluída com a resina amarela diluída em uma proporção de 1:1. Vórtice a resina verde completamente até que a cor seja homogênea.
      NOTA: A resina azul tem uma radiopacidade muito baixa que não é detectável com microCT, o que, portanto, requer diluição com resina amarela para criar duas resinas com diferentes rádiopacidades.
      ATENÇÃO: A resina pode conter cromato de chumbo, que é um cancerígeno. Produz gases venenosos em um incêndio. Manuseie com cuidado e descarte a resina como resíduos perigosos.
   5. Prepare dois conjuntos de injeção (conjunto de injeção #1 e conjunto de injeção #2) com tubos conforme descrito nas etapas 1.1.6-1.1.11.
      NOTA: Para camundongos adultos (>P30 (pós-natal 30) = P30 - 2 anos), use o conjunto de injeção #1 (tubo PE10 com 0,6 mm de diâmetro externo) para injeção comum de ducto biliar e conjunto de injeção #2 (tubo PE50 com 0,96 mm de diâmetro externo) para injeção de veia portal. Para camundongos pós-natais jovens (até P30), prepare dois conjuntos de injeção #1, um para o ducto biliar e outro para injeção de veia portal (sem injeção nº 2, pois a veia do portal é muito estreita para acomodar tubos PE50).
   6. Para preparar o conjunto de injeção nº 1, corte 30 cm de tubulação PE10 e estique uma extremidade da tubulação à mão puxando-a até ficar o mais fina possível (Figura 1A,B, aproximadamente 0,15 mm de diâmetro, tubo PE10 não esticado tem 0,6 mm de diâmetro).
   7. Corte a ponta da tubulação PE10 esticada na diagonal para criar uma ponta chanfrada (Figura 1B).
   8. Conecte a extremidade não esticada da tubulação PE10 a uma agulha de 30 G (Figura 1A, conjunto de injeção #1).
   9. Para preparar o conjunto de injeção #2, corte 30 cm de tubulação PE50 e estique uma extremidade da tubulação à mão puxando-a até ficar fina o suficiente para caber na veia portal (Figura 1A,B, aproximadamente 0,7 mm, tubo PE50 não esticado tem 0,96 mm de diâmetro).
   10. Corte a ponta da tubulação PE50 esticada na diagonal para criar uma ponta chanfrada (Figura 1B).
   11. Conecte a extremidade não esticada da tubulação PE50 a uma agulha de 23 G (Figura 1A, conjunto de injeção #2).
       NOTA: Cada conjunto de injeção só pode ser usado para uma injeção, uma vez que a resina endurecerá na seringa e na tubulação. Ajuste o tamanho da ponta esticada e chanfrada com base no tamanho do ducto biliar comum e da veia portal do mouse, dependendo de sua idade, genótipo e fenótipo. Quando não tiver certeza sobre o tamanho e o ajuste da tubulação, insira a tubulação no duto ou vaso apropriado após a incisão e antes que a tubulação esteja cheia de resina. Se o tubo for muito largo para caber no duto/vaso, estique-o ainda mais.
   12. Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (primeiro 4% na câmara de indução e ~2% usando o cone do nariz).
   13. Coloque o mouse em um banco ventilado em uma almofada de dissecção enquanto o mouse está respirando isoflurane através do cone do nariz. Verifique se o animal está inconsciente por um método recomendado pelo instituto/IRB, por exemplo, beliscando uma das patas.
       ATENÇÃO: A isoflurano pode causar sonolência ou tontura após a inalação e pode causar danos ao sistema cardiovascular e ao sistema nervoso central através de exposição prolongada ou repetida. Não inale. Manuseie a substância em um banco ventilado e em áreas bem ventiladas.
       NOTA: É possível utilizar outro método de anestesia, desde que seja compatível com perfusão cardíaca.
   14. Uma vez que o animal esteja inconsciente, pulverize o lado ventral com 70% de etanol para evitar interferência de peles.
   15. Usando tesoura de pele, corte a pele, fáscia e camada muscular começando na linha média da cavidade abdominal e corte até a cavidade torácica para expor os órgãos internos.
   16. Pegue o processo xifoide com fórceps para levantar o esterno e corte o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados para expor o coração e os pulmões.
   17. Remova a caixa torácica cortando as costelas nos lados esquerdo e direito da caixa torácica com uma tesoura. Tome cuidado extra para não danificar o fígado, pois isso resultará em vazamento da resina.
   18. Usando fórceps retos, puxe o coração em direção ao fígado e corte o átrio direito.
   19. Insira uma agulha borboleta (23 G), conectada a uma bomba de perfusão peristáltica, no ventrículo esquerdo. Perfumar o rato transcardialmente com a solução de sal balanceada Hanks (HBSS) e heparina (1 U/g de peso corporal do rato). Perfuuse por 3 min com uma taxa de perfusão de 5 mL/min.
       NOTA: Se o rato estiver sendo perfundido corretamente, os órgãos internos ficarão pálidos, especialmente o fígado. Se, em vez disso, os pulmões estiverem ficando brancos, a agulha é inserida no ventrículo direito e deve ser reposicionada. Após a perfusão, o rato é exsanguinado e pode ser removido do cone do nariz e isoflurane.
   20. Desligue a bomba de isoflurane.
2. Injeção de resina - Fundição de resina do sistema biliar
   1. Mova o rato para o microscópio de dissecção, abdômen para cima, cauda em direção ao experimentador, e vá para longe do experimentador. Os marcos anatômicos de interesse são retratados na Figura 2A.
   2. Localize a veia cava inferior (Figura 2A) movendo o intestino para o lado. Use uma tesoura de mola para fazer uma pequena incisão transversal na veia cava inferior para permitir a liberação de pressão vascular hepática (Figura 2Bi).
   3. Expor o ducto biliar comum e a veia portal conforme descrito nas etapas 1.2.4- 1.2.6.
   4. Mova o intestino e o pâncreas para o lado direito (do experimentador) usando um cotonete de algodão com tampo tampão de fosfato (PBS).
   5. Gire o lado ventral do fígado em direção ao coração usando o cotonete de algodão molhado pbs para expor a superfície visceral e a região hilar.
   6. Localize o ducto biliar comum que corre da região hilar através do pâncreas e para o intestino no esfíncter de Oddi (Figura 2Bii, ducto biliar comum delineado com a linha pontilhada amarela, pontas de flecha preta apontam para Esfíncter de Oddi).
      NOTA: Certifique-se de que o fígado está úmido durante todo o procedimento, polvilhando-o com PBS.
   7. Tecido ao redor claro (área ~ 5 mm) do ducto biliar comum usando fórceps retos. Coloque a rosca de sutura de seda (tamanho 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm de comprimento) sob o ducto biliar comum (Figura 2Bii) e amarre um nó de mão solta ao redor do ducto biliar comum (Figura 2Biii).
      NOTA: Escolha uma área para o nó no meio do caminho entre a região do hilar e o esfíncter de Oddi e a alguma distância da veia portal para que após a sutura seja apertada ao redor do ducto biliar comum, ela não interfira na injeção venosa do portal.
   8. Segure a tesoura de mola plana contra o ducto biliar comum para fazer uma incisão oblíqua ao ducto biliar comum no local onde o ducto biliar comum entra no pâncreas e no intestino ao lado do esfíncter de Oddi. (Figura 2Biv), linha pontilhada amarela descreve o esfíncter da região de Oddi, enfatizado por pontas de flecha pretas).
      NOTA: Este é um passo crucial. Faça um corte oblíquo e não transversal, e faça uma incisão; não corte o ducto biliar. Cortar todo o ducto biliar torna a inserção da tubulação muito desafiadora.
   9. Pouco antes do uso, misture 1 mL da resina amarela com 50 μL do agente de cura (preenchendo e esvaziando a seringa de 1 mL) e encha uma seringa Luer de 1 mL com a mistura de agente de cura .
   10. Conecte a seringa encheu com a tubulação (conjunto #1). Pressione o êmbolo para encher completamente a tubulação. Certifique-se de que o agente de resina/curaoma gotejamentos da ponta do tubo.
       NOTA: Evite e remova bolhas na seringa e tubos para obter melhores resultados.
   11. Utilizando fórceps, endireitar a área ao redor da incisão comum do ducto biliar e inserir a tubulação na abertura no ducto biliar comum (Figura 2Bv), com a borda mais longa da ponta chanfrada para baixo em direção ao lado dorsal do ducto biliar. Essa orientação garante que a resina possa sair da abertura do tubo, que está voltada para cima, para o duto (Figura 2Bv).
   12. Aperte o nó de rosca de seda para fixar o tubo dentro do ducto biliar comum (Figura 2Bvi).
   13. Injete a resina no ducto biliar comum. Observe a vesícula biliar e os lobos hepáticos individuais.
   14. Massageie o fígado com um cotonete de algodão molhado pbs para ajudar a espalhar a resina igualmente. Os ramos terminais dos dutos biliares cheios de resina (em camundongos do tipo selvagem) são ligeiramente visíveis na superfície hepática.
       NOTA: O tempo esperado para encher o fígado é de 30 a 100 s.
   15. Pare de injetar a resina quando pontos de resina aparecerem na superfície do fígado (Figura 2Ci, pontas de flecha azul) ou quando a resistência for atingida.
       NOTA: Trabalhe o mais rápido possível, pois a resina começa a endurecer após a adição do agente de cura da resina. O tempo de trabalho da adição do agente de cura é de aproximadamente 15 minutos.
   16. Remova a tubulação puxando-a para fora do ducto biliar comum e aperte rapidamente o nó de seda usando fórceps para evitar que a resina vaze. Corte as pontas soltas da sutura de seda, para que elas não interfiram com a injeção de veia portal.
   17. Descarte a tubulação contendo resina e a resina restante nos resíduos perigosos e a agulha nos resíduos afiados.
3. Injeção de resina - Fundição de resina venosa portal
   1. Limpe a veia do portal (área ~5 mm) de seu tecido circundante cerca de 2 cm de sua entrada para o fígado usando fórceps retos. Coloque a rosca de sutura de seda (tamanho 4-0, 0,17 mm, 3 - 5 cm de comprimento) sob a área desmatada da veia portal (Figura 2Ci) e amarre um nó de mão solta (Figura 2Cii).
   2. Faça uma incisão longitudinal na veia portal distal para o fígado e o nó (Figura 2Ciii).
   3. Misture 1 mL da resina verde com 50 μL do agente de cura (enchendo e esvaziando uma seringa de 1 mL) e encha a seringa Luer de 1 mL com a mistura de agente de cura de resina.
   4. Conecte a seringa recheada com a tubulação (conjunto #2 para ratos >P30, novo conjunto #1 para ratos NOTA: Evite e remova bolhas na seringa e tubos para obter melhores resultados.
   5. Usando fórceps, endireitar a veia do portal puxando o tecido circundante em direção ao experimentador e inserir o tubo com a borda mais longa da ponta chanfrada em direção ao lado dorsal do vaso (Figura 2Ciii).
   6. Aperte o fio de seda para fixar o tubo na veia do portal.
   7. Injete a resina na veia do portal. Observe os vasos sanguíneos enchendo com resina. Massageie o fígado com um cotonete de algodão molhado pbs para ajudar a espalhar a resina igualmente (Figura 2Civ).
   8. Pare de injetar a resina quando todos os vasos sanguíneos estiverem cheios (extremidades das veias do portal são visíveis na periferia do fígado) ou quando a resistência é atingida.
      NOTA: Trabalhe rápido, pois a resina começa a endurecer após a adição do agente de cura. O tempo de trabalho da adição do agente de cura é de aproximadamente 15 minutos para o conjunto de injeção #1 e 25 min para o conjunto de injeção #2.
   9. Remova a tubulação puxando o tubo da veia do portal e aperte rapidamente o nó de seda usando fórceps para evitar que a resina vaze.
   10. Descarte a tubulação contendo resina e a resina restante nos resíduos perigosos e a agulha nos resíduos afiados.
4. Dissecção e fixação hepática
   1. Disseca todo o fígado cortando-o do tecido circundante e do diafragma.
   2. Coloque suavemente todo o fígado em um tubo cônico vazio de 50 mL com o lado ventral voltado para cima e o lado dorsal descansando na parede do tubo cônico para evitar a deformação do fígado. Armazene o tubo cônico horizontalmente durante a noite a 4 °C para que a resina endureça completamente.
      NOTA: Qualquer recipiente que seja grande o suficiente para caber no fígado pode ser usado em vez de tubo cônico de 50 mL. O uso de um recipiente fundo plano aumentará a probabilidade de que o fígado não esteja deformado.
   3. Separe o fígado em lóbulos individuais. Faça uma seleção dos lóbulos que serão utilizados para análise microCT (1.4.4-1.4.5) ou controle de qualidade (1.4.6-1.4.8). Opcionalmente, use todo o fígado para limpeza óptica e microCT sem separá-lo em lóbulos individuais.
      NOTA: A arquitetura hepática dos sistemas biliar e vascular é diferente em cada lobo, e são, portanto, necessárias análises de lobos combinados. A limpeza óptica não interfere na digitalização de microCs, e o lobo(s) usado para controle de qualidade pode ser posteriormente escaneado com microCT. Por outro lado, as amostras escaneadas com microCT podem ser posteriormente eliminadas opticamente para comparação. Toda a análise hepática é assim possível. Em camundongos do tipo selvagem (fundo genético C3H/C57bl6), o lobo medial direito é preenchido primeiro por injeções de resina, tornando este um lobo adequado para análise de microCs, com a maior reprodutibilidade. O lobo lateral esquerdo é o maior lobo, no qual é, portanto, simples de pré-tela para qualidade de injeção. A seleção do lobo (ou fígado inteiro) utilizado para controle de qualidade e microCsedepende do modelo animal e da questão da pesquisa.
   4. Em um capô ventilado, prepare 4% de solução de formaldeído (10 -20 mL por tubo). Fixar os lóbulos usados para microCT com 4% de formaldeído durante a noite a 4 °C e depois lavar uma vez com PBS (10 -20 mL por tubo).
   5. Coletar resíduos de formaldeído em um recipiente separado. Mantenha os lóbulos do fígado em PBS a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou 70% de etanol para armazenamento a longo prazo. Prossiga com a seção 2: Tomografia microcomputada.
      ATENÇÃO: O formaldeído causa toxicidade aguda se engolido, inalado ou em contato com a pele. Formaldeído é um líquido inflamável e vapor. Causa queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Pode causar uma reação alérgica à pele. Fatal se inalado (concentrado ou em pó). Pode causar irritação respiratória. Suspeito de causar defeitos genéticos. Pode causar câncer. Causa danos aos órgãos (olhos, sistema nervoso central). Declarações de precaução - mantenha-se longe do calor, superfícies quentes, faíscas, chamas abertas e outras fontes de ignição. Nada de fumar. Use luvas de proteção e roupas de proteção. Em caso de derramamento, retire imediatamente todas as roupas que estavam contaminadas. Se estiver em contato com a pele: enxágue a área contaminada com água. Se inalado: remova a pessoa para o ar fresco e monitore a respiração se estiver confortável. Ligue imediatamente para um centro de venenos/ médico. Se nos olhos: enxágue os olhos com água por vários minutos. Se estiver presente e possível, remova as lentes de contato.
   6. Para controle de qualidade, fixe os lóbulos restantes (pelo menos um) com 50% de metanol (misturado com água deionizada) por um mínimo de 4h, balançando à temperatura ambiente, seguido por 100% de metanol durante a noite balançando à temperatura ambiente. Coletar resíduos de metanol em um recipiente separado.
      ATENÇÃO: O metanol causa toxicidade aguda se engolido, inalado ou em contato com a pele. Metanol é um líquido inflamável e vapor. Use luvas de proteção e roupas. Evite respirar ao manusear e mantenha-se afastado do fogo e do calor. Lave bem a pele depois de usar. Em caso de derramamento, retire imediatamente todas as roupas contaminadas. Enxágüe a pele com água. Se inalado: Remova a pessoa para o ar fresco e mantenha-se confortável para respirar. Se inalado, engolido ou exposto, ligue para um centro de venenos/ médico.
   7. Em um capô ventilado, prepare a solução de álcool benzílico e benzil (BA: BB, 1:2) (5 -10 mL por lobo).
   8. Coloque o lobo hepático em um tubo de polipropileno de 15 ou 50 mL (dependendo do tamanho do lobo) contendo solução BABB. Deixe balançando à temperatura ambiente até transparente. Esta etapa pode levar entre 2-16 h, dependendo do tamanho do lobo.
      NOTA: A solução BABB dissolve certos tipos de plástico. É seguro armazenar as amostras em tubos de polipropileno ou recipientes de vidro.
      ATENÇÃO: Benzoato de benzílico pode causar toxicidade aguda quando engolido. É tóxico para a vida aquática com efeitos duradouros. Declarações de precaução: lave bem a pele após o manuseio. É prejudicial quando engolido, em contato com a pele, ou inalado. Evite respirar vapores/vapores. Lave bem as mãos após o manuseio. Não coma, beba ou fume ao usar este produto. Se for engolido - ligue para um centro de veneno/médico se não estiver bem Use em áreas ventiladas. Coletar derramamento. Descarte o conteúdo/recipiente para uma usina de disposição de resíduos aprovada.
   9. Inspecione a qualidade da injeção. Apenas fígado bem injetado deve ser escaneado com microCT.

2. Tomografia microcomputnada

1. Preparação da amostra
   1. Prepare 1% de gel de agarose misturando 100 mL de água destilada e 1 g de pó de agarose. Coloque a mistura em um micro-ondas e ferva a solução até que o pó de agarose se dissolva.
   2. Tempere o gel de 1% de agarose a ~40 °C para evitar danos térmicos à amostra hepática.
   3. Coloque o lóbulo(s) de interesse em um tubo cônico de 15 mL e encha-o com o gel de 1% de agarose para aproximadamente 2/3 do volume total do tubo. Esta etapa minimiza o movimento amostral indesejado durante a medição da TC.
2. Medição da tomografia
   NOTA: As seguintes etapas são dependentes de dispositivos CT, e configurações e ações específicas podem diferir para diferentes dispositivos ct e fabricantes. Neste protocolo, o scanner de tomografia microcomputante utilizado foi equipado com um tubo de raios-X nanofoco (180 kV/15 W), e dinâmico de painel plano 41|100 (4048 px x 4048 px, tamanho do pixel 100 mm com binning 2) para as medições ct.
   1. Monte o tubo cônico de 15 mL com a amostra no estágio rotacional de um dispositivo CT e permita que ele se adapte termicamente à câmara de medição por pelo menos 1 h.
   2. Quando a amostra estiver adaptada termicamente, centralize-a no Campo de Visão (FOV).
   3. Otimizar as distâncias de amostra de origem e detector de amostras (SSD, SDD) para atingir resolução de voxel suficiente, por exemplo, 12 μm para uma amostra hepática murina adulta ou 6,5 μm para fígado
   4. Defina os parâmetros de aquisição (ou seja, acelerando a tensão e a corrente, exposição, binning, média) seguindo as recomendações do fabricante do dispositivo CT para atingir um nível suficiente de sinal detectado. Esses parâmetros não são apenas dependentes de dispositivos CT, mas também dependentes de amostras e devem ser otimizados para cada amostra. Em Hankeova et ^al.9, as configurações foram: tensão acelerada de 80 kV, corrente acelerada de 160 μA, tempo de exposição de 400 ms e 2000 imagens.
   5. Inicie uma medição de tomografia. Use um software dedicado de reconstrução tomográfica para reconstruir os dados ct.

3. Análise e segmentação de dados

NOTA: As seguintes etapas são dependentes de software de processamento de imagem; configurações e ações específicas podem diferir dependendo do software utilizado.

1. Carregar os dados ct: Selecione Arquivo > Importar > Comando. Uma nova seleção depende do formato específico dos dados do CT a serem processados.
2. Use a função Determinação de superfície no painel superior para segmentar a resina nos dados usando limiar global. Na janela de diálogo, determine o valor limiar com a avaliação do histograma definindo a posição da linha "Isovalue" vermelha para segmentar apenas os vasos cheios de resina (ou seja, englobados pela linha amarela no apresentado "painel de visualização") (Figura 3A).
3. No painel esquerdo, selecione o módulo Criar ROI a partir de Volume/CAD/Malha para criar uma região de interesse (ROI) dos vasos cheios de resina. Na janela de diálogo, use a opção Criar ROI(s) do Solid, selecione o nome do volume processado e confirme.
4. Eliminar a segmentação errônea de clusters de ruído na região de fundo deste ROI. Marque este ROI no painel direito, clique com o botão direito do mouse nele e selecione o ROI Split do módulo.
5. Na janela de diálogo, defina o parâmetro de volume mínimo [voxel] para excluir todas as partículas de ruído - esse valor é experimentado e dependente de dados e deve ser otimizado para que cada amostra seja analisada (Figura 3B).
6. Crie máscaras de canal suaves, contínuas e sólidas sem artefatos no ROI resina-fundido - por exemplo, presença de bolhas de ar ou vazamento de resina.
7. No painel esquerdo, use o módulo Suavização, defina o parâmetro Força de Suavização para 1 ou 2 (dependendo dos dados individuais, quando valores mais altos podem levar à deformação do modelo, especialmente quando se trata de estruturas finas). Se necessário, execute este processo duas vezes (Figura 3C).
8. Identifique e separe os sistemas tubulares individuais na máscara de resina segmentada.
   1. Crie um ROI separado para o sistema preenchido com a resina mais absortiva (a resina amarela usada para a injeção comum do ducto biliar) com valores de maior intensidade nos dados da tomografia. Siga o procedimento descrito na etapa 3.2. (Figura 3Di).
   2. Marque o novo ROI e o ROI da máscara de resina, clique com o botão direito do mouse e selecione Subtract ROI(S) e subtraia o novo ROI do ROI da máscara de resina para criar um novo ROI para o sistema tubular restante (Figura 3Dii, iii).
9. Exporte os ROIs resultantes para ambos os sistemas tubulares em vários formatos, com base nas preferências do operador, para processamento subsequente em diferentes softwares. Além disso, processe os ROIs resultantes em um software gráfico de volume para exportar a visualização final na forma de uma imagem ou um vídeo.

Resultados

O que fazer
A injeção de resina dupla bem sucedida é alcançada quando ambos os dutos biliares intrahápticos e a vasculatura da veia portal estão bem preenchidos. Como etapa de controle de qualidade, a limpeza de um lobo (por exemplo, o lobo lateral esquerdo) permite a verificação de uma injeção bem sucedida, seguida de imagem de lóbulos de interesse. O lobo limpo opticamente pode ser escaneado posteriormente usando microCT; portanto, é possível limpar o fígado óptico. No fígado de rato bem injetado, a vasculatura da veia portal deve ser preenchida com resina até que a periferia do fígado e a resina devem ser visíveis em ramos laterais (Figura 4), e esta arquitetura é fielmente recapitulada em dados microCT digitalizados e segmentados. Além disso, os dutos biliares intrahápticos bem injetados devem ser visíveis ao lado dos principais ramos da veia do portal que se estendem quase até a periferia, e a resina deve ser visível nos principais ramos laterais. Se o lobo de controle passar pela etapa de controle de qualidade, os lóbulos de interesse (incluídos o desmatado opticamente) podem ser escaneados com microCT. O resultado dos dados segmentados de um fígado bem injetado é mostrado para um rato P15 (Figura 4A,B) e um rato adulto (Figura 4C,D).

O que não fazer
Tecido hepático intacto é um pré-requisito para injeção bem sucedida. Tome cuidado extra ao cortar a cavidade abdominal e o diafragma para não cortar acidentalmente o tecido do fígado. Se houver danos físicos ao fígado durante este procedimento, é muito provável que a resina vaze durante a injeção de veia portal (Figura 5A). Não é possível conseguir uma boa injeção do sistema vascular se o fígado estiver fisicamente danificado.

Um dos erros comuns é subabastecer o fígado com resina que pode levar a desafios para visualização ou análise. Uma das causas para o subabastequimento do sistema é o endurecimento da resina prematuramente na agulha ou a ponta da tubulação antes da injeção ser concluída (Figura 5B, pontas de flecha azul, suportes retratam grandes bolhas). Uma boa prática é usar um conjunto de injeção por animal e trabalhar rápido depois que o agente de cura é adicionado à resina. Se a resina endurecer durante a injeção (que pode ser observada por um sistema meio cheio, aqui exemplificada com uma vasculatura venosa de portal meio cheia) retire a tubulação, corte a ponta do tubo (sempre na diagonal para criar uma ponta chanfrada) e empurre o êmbolo. Se a resina começar a gotejar novamente, reinsira cuidadosamente a tubulação e fixe-a com a sutura. Se a resina tiver endurecido na agulha, substitua completamente o tubo, encha-o com resina (evitando bolhas), reinsira cuidadosamente o tubo e fixe-o com a sutura. Pode ser desafiador substituir a tubulação, especialmente em camundongos pós-natais jovens Figura 5C, pontas de flecha azul denotam sangue visível em galhos terminais). Isso pode ser observado quando as pontas dos vasos são preenchidas com sangue em vez de resina. Para evitar isso, certifique-se de que a veia portal (fora do fígado) não contenha sangue antes da injeção. A terceira causa do fígado subabastecido é quando a tubulação é inserida muito profundamente no fígado e entra em um galho em direção a um dos lóbulos. Para evitar isso, insira o tubo a um mínimo de 0,5 cm da entrada para o fígado.

Por outro lado, um, ou ambos, dos sistemas ficam sobrecarregados com resina (Figura 5D). É necessário monitorar visualmente o fígado durante toda a injeção. O revestimento do sistema biliar com resina é mais desafiador do que o fundição de resina venosa portal, uma vez que os dutos cheios de resina são apenas levemente visíveis na superfície hepática, e é difícil avaliar quando o sistema está quase cheio e quando parar. Quando pequenos pontos de resina amarela aparecem na superfície do fígado (Figura 2Ci, ponta de flecha azul), este é um sinal de que o sistema biliar está completamente preenchido, e a resina está começando a vazar para fora dos dutos. O pequeno vazamento de resina pode ser corrigido manualmente durante a segmentação de dados microCT (Figura 5D, painéis à direita).

Se a pressão de injeção for muito alta, isso pode causar a ruptura de vasos ou dutos (Figura 5E), danificando irreversivelmente a arquitetura de vasos ou dutos. O fígado não será adequado para varredura ou análise de microCT. Para evitar o excesso de resina, otimize o volume certo e a pressão usados para injeção em cada modelo do mouse. Ao trabalhar com camundongos que foram desafiados com uma dieta tóxica, modificação genética ou lesão hepática que afeta os sistemas biliar ou venoso, ou rigidez hepática, a pressão e o volume de injeção podem precisar ser ajustados, pois o volume e a pressão tolerados podem ser diferentes dos ratos do tipo selvagem. Este protocolo descreve a injeção manual dos dois sistemas, mas é possível conectar a seringa a uma bomba para padronizar a pressão de injeção. Bolhas são outro artefato de injeção muito comum que leva ao enchimento esparso das redes tubulares (Figura 5F-H, pontas de flecha azul). Para evitar a formação de bolhas, certifique-se de que a seringa e a tubulação não contenham bolhas, estejam completamente cheias de resina, e a resina esteja pingando da ponta da tubulação antes da injeção. Pequenas bolhas que aparecem como áreas negativas nos dados do microCT podem ser corrigidas manualmente durante as etapas pós-processamento, embora isso seja trabalhoso.

Fresco é o melhor
O uso de resina amarela fresca é um fator crucial, afetando significativamente o contraste das duas resinas e a segmentação de dados microCT. Quando a resina recém-aberta é usada (Figura 6A) há uma clara diferença no contraste entre os dutos biliares injetados por resina amarela (branco brilhante) e as veias de portal injetadas em resina verde (cinza brilhante). O fígado injetado com resina fresca é facilmente processado usando limiares globais automatizados. Com armazenamento prolongado, a resina precipita, e o contraste diminui. Após 3 meses de armazenamento, o contraste ainda pode ser suficiente para distinguir a veia portal do ducto biliar (Figura 6B), mas a precipitação afeta a mistura das duas resinas, que é visível como uma opacidade heterogênea na veia do portal preenchido (Fig 6B, pontas de flecha azul). O contraste heterogêneo afeta negativamente o limiar automatizado e requer correções manuais, o que aumenta o tempo de processamento. Se a resina for maior de seis meses, o contraste se degradou a um ponto em que não é possível distinguir o ducto biliar injetado em amarelo da veia portal injetada pelo verde com base apenas em seu contraste (Figura 6C). Neste caso, o ducto biliar e a veia portal devem ser segmentados manualmente com base em seu diâmetro e posição na região hilar e acompanhados manualmente por todo o dado microCT. Este procedimento é extremamente demorado e melhor evitado.

Figura 1: Conjunto de injeção para fundição de resina. (A) O conjunto de injeção nº 1 compreende uma agulha de 30 G e uma tubulação PE10 de ~30 cm de comprimento. O conjunto de injeção #2 é composto por uma agulha de 23 G e tubos PE50 ~30 cm de comprimento. (B) A ponta da tubulação é esticada e cortada em um ângulo para criar uma ponta chanfrada. A régua em A e B é uma régua de centímetros, com grandes incrementos de 1 cm, incrementos intermediários de 5 mm, e pequenos incrementos de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Gráfico de fluxo de fundição de resina dupla. (A) Esquemático mostrando o sistema circulatório venoso murino e o coração com átrio direito destacado, que deve ser cortado antes da perfusão, e o ventrículo esquerdo no qual a agulha deve ser inserida para a perfusão para lavar o sangue do sistema circulatório. A veia cava inferior deve ser cortada sob os rins para aliviar a pressão vascular. (B) Gráfico de injeção de resina do ducto biliar. i Imagem de zoom de (A) representando onde cortar o IVC. (ii) Imagem representando o ducto biliar comum (linha pontilhada amarela) da região do fígado hilar até o esfíncter de Oddi (pontas de flecha preta), com fio de sutura sob o ducto biliar comum limpo. (iii) Posição adequada para nó de mão sobre mão solta em torno do ducto biliar comum. (iv) A linha pontilhada amarela e as pontas das flechas pretas rotulam o esfíncter de Oddi, demonstrando o ângulo oblíquo para incisão e como a abertura deve aparecer após a incisão do ângulo oblíquo. v Esquema demonstrando a orientação da abertura de bip do tubo PE10 (para cima) após a inserção. (vi) Aparecimento de resina amarela sendo injetada; a resina deve facilmente passar o nó frouxamente amarrado. IVC, veia cava inferior; CBD, ducto biliar comum. (C) Gráfico de injeção de resina venosa portal. (i) A linha pontilhada verde marca a veia portal da região de Hilar. As pontas das flechas azuis rotulam o sistema biliar sobrecarregado. (ii) Local adequado para nó de mão solta ao redor da veia do portal. (iii) Esquemático demonstrando a abertura de bisel (para cima) após a inserção. (iv) Aparecimento de fígado após injeção de resina verde e resina amarela; note o vaso sanguíneo cheio de resina na periferia do fígado. PV, veia portal. A Figura 2A foi criada com Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Processamento de dados micro CT em software gráfico de volume. (A) Determinação de superfície, (i) isovalor superestimado (atual prévia da seleção é mostrado na cor amarela), (ii) isovalor subestimado, (iii) seleção ideal de isovalor para determinação adequada da superfície dos canais de veia portal e biliares. (B) Região de interesse de divisão (ROI) criada por determinação superficial, (i) definir o valor na janela de diálogo alto o suficiente para que apenas um segmento (o maior) permaneça, (ii) em quadros amarelos as partículas menores (excluídas) são mostradas. (C) A suavização superficial dos dados, (i) função de alisamento está no painel esquerdo, (ii) definir a força de suavização para 1 (máx. 2) e criar novos dados alisados do ROI, (iii). (D) A separação dos sistemas tubulares individuais, (i) na função de determinação da superfície definir o isovalor para que apenas o sistema biliar seja incluído na seleção (a visualização atual da seleção é mostrada na cor amarela), (ii) marcar o ROI de ambos os sistemas e o ROI de apenas o sistema biliar e o sistema biliar subtrato do ROI de ambos os sistemas, (iii) Veia de portal mostrada em cinza, o sistema biliar mostrado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Sistemas de ducto biliar bem injetado (BD) e veia portal (PV). (A) Sistema de lobo medial direito (RML) do fígado pós-natal 15 (P15) injetado com duas resinas nos dois sistemas. Escala barra 1 mm. (B) renderização 3D de P15 RML mostrada em (A) representando vasculatura veia portal em branco e sistema biliar em verde. Barra de escala 1 mm. (C) RML desmatada óptica de fígado adulto injetado com duas resinas nos dois sistemas. Escala barra 1 mm. (D) renderização 3D de RML adulto mostrado em (C) representando vasculatura veia portal em branco e sistema biliar em verde. H = hilar, P = periférico. Barra de escala 1 mm. Os painéis A, B, D são adaptados com permissão de Hankeova et ^al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Desafios comuns de injeções de fígado de resina dupla. (A) A imagem retrata um fígado que foi acidentalmente cortado durante a abertura inicial da cavidade abdominal, e a resina está vazando através do corte (ponta de flecha azul). (B) Sistema de veia portal mal injetado devido ao endurecimento da resina. Pontas de flecha azul rotulam galhos terminais vazios, e suportes vermelhos rotulam grandes bolhas. Barra de escala 1 mm. (C) Sistema venoso portal mal injetado devido à má perfusão transcárquia. Pontas de flecha azul rotulam o sangue visível nos galhos terminais. Barra de escala 1 mm. (D) Sistema biliário sobrenchido manifestado por bolas isoladas de resina. Os painéis esquerdos mostram o fígado limpo opticamente, e os painéis direito mostram a imagem renderizada 3D microCT. Os contornos pontilhados azuis retratam regiões de zoom. As pontas das flechas pretas rotulam uma parte do fígado que foi danificada durante a limpeza óptica após a varredura de microCT. Barra de escala 1 mm. (E) Alta pressão durante a injeção de resina pode causar ruptura da veia portal (o animal neste painel carrega uma mutação Jag1H268Q), marcada por pontas de flecha azul. Barra de escala 1 mm. (F) Bolhas na resina durante a injeção de veia portal (pontas de flecha azul) e (G) injeção do sistema biliar (ponta de flecha azul), barra de escala 1 mm. (H) Varredura microCT de bolhas (ponta de flecha azul), galhos terminais mal preenchidos (suportes vermelhos) e vazamento de resina (ponta de flecha amarela), barra de escala 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Contraste diferencial da resina. (A) Resina amarela recém-aberta gera contraste suficiente para distinguir veia portal injetada em resina (cinza) e ductos biliares (brancos). (B) O armazenamento de três meses de resina amarela leva à precipitação da resina resultando em opacidade heterogênea (veia portal cinza-branco, ponta de flecha azul). (C) O armazenamento prolongado (>6 meses) de resina amarela diminui o contraste entre a veia portal (cinza) e os canais biliares (cinza). Barra de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Várias etapas críticas determinam o sucesso do DUCT, desde a preparação da amostra até os parâmetros do dispositivo CT. Para alcançar os melhores resultados, resina bem contrastada, bem injetada e sem bolhas deve ser usada para permitir o processamento digital simples com limiar automatizado para obter dados, imagens e filmes 3D. Com o treinamento e seguindo este protocolo, 90% das injeções são bem sucedidas e resultam em dados reprodutíveis. É importante usar resina amarela fresca para obter o melhor contraste entre os dois sistemas injetados. A resina amarela tem uma radiopacidade muito forte, enquanto a resina azul tem uma radiopacidade indetectável. Os melhores resultados são alcançados nos primeiros três meses após a abertura de uma nova garrafa de resina amarela. Com o tempo, a resina precipita, e após um armazenamento mais longo (>6 meses), as resinas amarelas e verdes não serão mais distinguidas nas tomografias. Imagens com baixo contraste exigem rastreamento manual extenso e demorado e segmentação dos dois sistemas. Em seguida, tubos bem esticados são indispensáveis para caber no ducto biliar comum de camundongos adultos e ducto biliar comum e veia portal de camundongos pós-natais. O ponto de entrada para a injeção deve ser criado com cuidado. Se o ducto biliar comum for aberto transversalmente, é provável que se desprende do tecido circundante, impedindo a entrada bem sucedida da tubulação. Este passo é especialmente delicado para camundongos pós-natais em que o ducto biliar comum se retrai e "enrola- se" se tiver se separado de seu tecido circundante, tornando a inserção da tubulação extremamente desafiadora. A entrada e injeção do ducto biliar comum podem exigir alguma prática. Ao preparar a tubulação com resina e toda a injeção, evite a formação de bolhas, pois as bolhas criarão espaço negativo nas imagens ct e exigirão correção manual demorada. É importante massagear suavemente o fígado rolando sobre sua superfície com um cotonete de algodão molhado durante e após o procedimento de injeção, pois isso facilita até mesmo a propagação da resina. Após a conclusão da injeção e remoção do tubo, o nó de sutura de seda deve ser apertado de forma rápida e cuidadosa, para que a resina não flua para fora do fígado antes que polimerize completamente. Para imagens microCT bem sucedidas, a amostra deve ser adequadamente fixada no lugar com agarose e adaptada termicamente para eliminar artefatos de movimento nos dados da tomografia. As configurações de aquisição também são de fundamental importância, que devem ser otimizadas para alcançar uma resolução espacial adequada para resolver estruturas finas.

Modificações técnicas no procedimento de injeção podem ser feitas para obter injeção em camundongos mais jovens. Atualmente, a fundição de resina de fígados de rato mais jovens é limitada pela disponibilidade de tubos suficientemente finos, com PE10 sendo o menor tubo comercialmente disponível. Tanimizu et al. injetaram tinta de carbono com sucesso no ducto biliar comum do dia 17 (E17) usando capilares de ^vidro11. Testes futuros de se a resina pode ser entregue via capilar de vidro seria, portanto, de interesse. O DUCT foi ainda adaptado para injetar outros sistemas tubulares, como as vias aéreas e a vasculatura da artéria pulmonar dos ^pulmões9. A injeção dupla de resina também pode ser modificada para ser usada com outras resinas disponíveis comercialmente, ou este protocolo poderia ser usado para injeções com tinta de carbono.

Um dos principais fatores limitantes do gasoduto DUCT é a viscosidade da resina. O DUCT só pode ser usado para fundição de resina de estruturas tubulares acima de um diâmetro de 5 μm. Neste conjunto de dados, a resina poderia penetrar tubos com o menor diâmetro de 5 ^μm9. Essa limitação de tamanho impede a análise de dutos finos e pequenos capilares. Para avançar ainda mais o gasoduto DUCT para embarcações de menor calibre, outras resinas disponíveis comercialmente devem ser testadas, ou o desenvolvimento de novos agentes radiopaquenos de baixa viscosidade pode melhorar a penetração do lúmen.

Em Hankeova et ^al.9, o DUCT foi comparado com duas outras técnicas comumente utilizadas, injeções duplas de tinta de carbono seguidas de limpeza tecidual e fotografia padrão, e iDISCO+ com coloração dos vasos sanguíneos com actina de células musculares alfa-lisas e ductos biliares com citokeratina 7, seguido por imagens ^3D9. O DUCT superou os outros dois métodos em termos de análise dupla (o que foi desafiador para iDISCO+ devido à alta autofluorescência hepática), imagem 3D e quantificação (não possível com injeção de tinta de carbono) e lumenização (DUCT fornece dados para a arquitetura interna de lúmen e perfusão do sistema). Como mencionado acima, a principal limitação do DUCT é o tamanho mínimo de lúmen que pode ser injetado e analisado (limite de 5 μm), um parâmetro no qual tanto a injeção de tinta de carbono quanto o iDISCO+ tiveram melhor desempenho. O DUCT é superior ao fundição de resina de sistema único3,5,6 porque permite a análise de cada sistema injetado separadamente e também facilita a investigação 3D dupla para estudar a relação arquitetônica entre os dois sistemas.

O DUCT pode ser aplicado para estudar quaisquer duas redes tubulares em 3D. Como prova de princípio, o DUCT foi utilizado para visualizar os sistemas de veias hepáticas e portal e a vasculatura da artéria pulmonar e as vias aéreas no ^pulmão9. Os dutos biliares intrahápticos desenvolvem-se adjacentes à veia portal, e a veia portal fornece um modelo estrutural e centro de sinalização que regula o crescimento e diferenciação da árvore ^biliar12. Em Hankeova et ^al.9, a DUCT explorou a regeneração biliar em um modelo de camundongo para a doença pediátrica humana Síndrome de Alagille. O DUCT revelou mecanismos arquitetônicos não relatados anteriormente que o sistema biliar usou para alcançar um volume de tipo ^selvagem9. Os camundongos com síndrome de Alagille utilizaram duas estratégias diferentes: (1) nas regiões hilar e central do fígado, o sistema biliar aumentou sua ramificação, e (2) na periferia hepática, os ductos biliares gerados por novo eram altamente tortuosos. Estes dois fatores combinados para produzir um volume de sistema biliar quase normal, apesar da arquitetura anormal. Além disso, o DUCT detectou ramificações anormais do ducto biliar que ocorreram independentemente do ramificação da veia portal e dos canais biliares formando pontes de conexão entre duas veias do ^portal9. Esses fenótipos seriam impossíveis de detectar em fundição de resina única e poderiam ser mal interpretados em seções histológicas 2D como proliferação de ductos biliares. O DUCT fornece, assim, dados que descrevem a arquitetura 3D de duas redes tubulares em todo o nível de órgão ou lobo com a possibilidade de análise quantitativa qualitativa e aprofundada. O DUCT pode ser um novo padrão para o desenvolvimento do fígado pós-natal e análises de regeneração hepática em diferentes modelos animais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL SafeSeal micro tubes	Sarstedt	72.706
23 G butterfly needle with tubing	BD bioscience	367283
25 G needle	BD bioscience	305122
30 G needle	BD bioscience	305106
Agarose	Top-Bio	P045
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	108006
Benzyl benzoate	Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 mL tubes	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	polypropylene
Cotton swabs	Medicarier	60406
Dissection Microscope	Leica Camera AG		Leica M60
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	14190144
Ethanol 70%	VWR	83801.41
Falcon tube 15 mL	Verkon	331.850.084.006
Forceps curved	Fine Science Tools	11051-10	Fine Graefe 10 cm curved
Forceps straight	Fine Science Tools	11050-10	Fine Graefe 10 cm straight
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240	Waygate Technologoies		micro computed tomography scanner
Hanks' Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14025092
Heparin	Leo Pharma	B01AB01	5000 IE/mL
Isolfurane	Baxter	FDG9623
Methanol	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	synthetic resin yellow
MICROFIL	Flowtech	MV-120	synthetic resin blue
MICROFIL	Flowtech	MV-diluent	clear resin diluent
Pasteur pipette	Verkon	130.690.424.503
Peristaltic pump	AgnThos	010.6131.M20
phoenix datos|x 2.0 software	Baker Hughes		CT data reconstruction software
Rocker	VWR	444-0142
Silk suture	AgnThos	14757	Black silk, 4-0, sterile, 100 m
Skin scissor	Fine Science Tools	14058-09	Iris straight tip 9 cm
Spring scissor	Fine Science Tools	15000-03	Vannas micro, straight tip 2 mm
Syringe 1 mL Luer	BD bioscience	303172
Tubing PE10	BD bioscience	427401
Tubing PE50	BD bioscience	427411
VG Studio MAX 3.3 software	Volume Graphics GmbH		CT data processing and analysis software