Fabricação microfluida de microcápsulas core-shell carregando esferoides de células-tronco pluripotentes humanas

Resumo

Este artigo descreve o encapsulamento de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando um dispositivo de foco de fluxo coaxial. Demonstramos que essa tecnologia de encapsulamento microfluido permite a formação eficiente de esferoides hPSC.

Resumo

Culturas tridimensionais (3D) ou esferoides de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferecem os benefícios de melhores resultados de diferenciação e escalabilidade. Neste artigo, descrevemos uma estratégia para a formação robusta e reprodutível de esferoides hPSC onde um dispositivo de foco de fluxo coaxial é utilizado para prender hPSCs dentro de microcápsulas de conchas centrais. A solução central continha suspensão celular única de hPSCs e foi feita viscosa pela incorporação de poli de alto peso molecular (etileno glicol) (PEG) e mídia gradiente de densidade. O fluxo de conchas era composto por PEG-4 arm-maleimide ou PEG-4-Mal e fluiu ao lado do fluxo central em direção a duas junções de óleo consecutivas. A formação de gotículas ocorreu na primeira junção de óleo com a solução shell envolvendo-se em torno do núcleo. A interligação química da casca ocorreu na segunda junção de óleo introduzindo um crosslinker di-thiol (1,4-dithiothreitol ou DTT) nessas gotículas. O crosslinker reage com grupos funcionais de maleimiide via química de clique, resultando na formação de uma concha de hidrogel ao redor das microcápsulas. Nossa tecnologia de encapsulamento produziu cápsulas de 400 μm de diâmetro a uma taxa de 10 cápsulas por segundo. As cápsulas resultantes tinham uma concha de hidrogel e um núcleo aquoso que permitia que células únicas se reunissem rapidamente em agregados e formassem esferoides. O processo de encapsulamento não afetou negativamente a viabilidade dos hPSCs, com viabilidade >95% observada 3 dias após o encapsulamento. Para comparação, os hPSCs encapsulados em micropartículas de gel sólido (sem núcleo aquoso) não formavam esferoides e tinham <50% de viabilidade 3 dias após o encapsulamento. A formação esferoide de hPSCs dentro de microcápsulas de conchas núcleo ocorreu dentro de 48 h após o encapsulamento, com o diâmetro esferoide sendo uma função da densidade de inoculação celular. No geral, a tecnologia de encapsulamento microfluido descrita neste protocolo foi adequada para encapsulamento de hPSCs e formação de esferoides.

Introdução

Há um interesse considerável nas culturas 3D das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação proporcionada por esse formato de cultura ^1,2,3. hPSCs são tipicamente formados em esferoides ou outros formatos de cultura 3D por meio de bioreatores, microwells, hidrogéis e andaimes poliméricos ^4,5,6. Encapsulamento oferece outro meio para organizar hPSCs únicos em esferoides. Uma vez encapsulados spheroids hPSC podem ser tratados com facilidade e transferidos para placas de microtiter para diferenciação, modelagem de doenças ou experimentos de teste de drogas. Encostendo hPSCs em uma camada de hidrogel também protege as células contra danos à tesoura e permite cultivar esferoides em um bioreator a altas taxas de agitação⁷.

Nossa metodologia de encapsulamento de células-tronco evoluiu ao longo do tempo. Primeiro, focamos em micropartículas de hidrogel sólido e demonstramos o sucesso do encapsulamento e cultivo de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs)⁸. No entanto, observou-se que as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) tinham baixa viabilidade quando encapsuladas em tais micropartículas de hidrogel, presumivelmente devido à maior necessidade dessas células de restabelecer contatos celulares após o encapsulamento. Argumentamos que a microcápsula heterogênea, possuindo um núcleo aquoso, pode ser mais adequada para o encapsulamento de células que dependem do rápido restaneamento de contatos celulares. O conceito de fluxo coaxial com foco de dispositivo microfluido para fazer microcápsulas de conchas de núcleo/hidrogel aquosos foi adaptado a partir de He et ^al.9, mas em vez de alginato empregado na abordagem original, um hidrogel à base de PEG foi incorporado à concha. Primeiro demonstramos encapsulamento bem sucedido e formação esferoide de hepatócito primário em microcápsulas de conchas núcleo¹⁰ e mais recentemente descreveu o encapsulamento das células hES e iPS⁷. Conforme descrito na Figura 1A, as cápsulas são fabricadas em um dispositivo de focalizar o fluxo onde os fluxos de fluxo da concha e do núcleo transitam de fluxo lateral para o coaxial antes da ejeção para a fase do óleo. O fluxo do núcleo contém células e aditivos que aumentam a viscosidade da solução (PEG MW 35kD não reativo e iodixanol - nome comercial OptiPrep), enquanto o fluxo de conchas contém moléculas reativas (PEG-4-Mal). O fluxo de fluxo coaxial contínuo é discretizado em gotículas que retêm a arquitetura de conchas de núcleo. A estrutura do núcleo-shell é permanente pela exposição ao di-thiol crosslinker (DTT), que reage com PEG-4-Mal via química de clique e resulta na formação de uma fina (~10 μm) pele ou concha de hidrogel. Depois que a emulsão é quebrada e as cápsulas são transferidas para uma fase aquosa, moléculas de PEG se difundem do núcleo e são substituídas por moléculas de água. Isso resulta em microcápsulas aquosas do núcleo e da concha de hidrogel.

Fornecidos abaixo estão instruções passo a passo sobre como fazer dispositivos microfluidos, como preparar células e como realizar o encapsulamento de hPSCs.

Protocolo

1. Fabricação de dispositivos

1. Faça os projetos para o dispositivo de microencapsulação e dispositivo de dissociação usando o software CAD^10,11.
2. Gire as três camadas de fotoresist SU-8 sequencialmente em um wafer de silício (Figura 2A) para alcançar estruturas com as alturas desejadas: 60, 100 e 150 μm.
   NOTA: O processo para os moldes superior e inferior é idêntico.
   1. Gire um wafer de silício limpo de 10 cm com fotoresist negativo SU-8 2025 a 1.100 rpm para criar a primeira camada de 60 μm. Depois de um cozimento macio a 65 °C por 3 min e 95 °C por 10 min em uma placa quente, exponha o molde usando um alinhador sem máscara carregando o arquivo de design do padrão do canal principal para o PC μPG 101. Em seguida, prossiga com o cozimento pós-exposição a 65 °C por 3 min e a 95 °C por 10 min.
   2. Gire a segunda camada SU-8 2025 (40 μm) a 1.500 rpm e exponha carregando o arquivo CAD apropriado para o padrão do canal shell.
      NOTA: Os bolos macios e pós-exposição foram semelhantes à etapa anterior.
   3. Gire a terceira camada SU-8 2025 a 1.400 rpm para atingir 50 μm de altura e repetir o processo acima, mas exponha as estruturas para a fase do óleo.
   4. Desenvolva o molde com todas as três camadas em um único passo por submersão no desenvolvedor SU-8 até que todos os fotoresist não expostos sejam removidos.
   5. Asse duro o molde em uma placa quente a 160 °C por 10 minutos para melhorar a adesão e selar pequenas rachaduras que poderiam aparecer após o desenvolvimento.
   6. Exponha o molde ao clorofometilsilano para evitar a ligação de elastômero na próxima etapa e coloque-o em pratos petri de 15 cm até o uso.
3. Prepare o molde do dispositivo de dissociação da mesma forma, conforme descrito na Figura 1D e Figura 2B. Gire uma camada de fotoresist SU-8 em um wafer de silício, como descrito anteriormente na etapa 1.2.3, para alcançar estruturas com a altura desejada: 50 μm. Conduza o cozimento macio e pós-exposição, desenvolvimento e cozimento duro da mesma forma que a etapa anterior.
   NOTA: Uma matriz de postes em forma de triangular cobriu toda a câmara, com o espaçamento entre os postes diminuindo à medida que a largura da câmara diminuía em direção à tomada. Os postes triângulo foram de 200 μm por lado com um arremesso variando de 400 μm (na entrada) a 30 μm (na tomada).
4. Prepare os moldes por litografia macia usando poliditilsiloxano (PDMS).
   1. Misture base de elastômero PDMS e agente de cura de elastômero em uma proporção de 10:1 w/w em uma centrífuga planetária. Despeje a mistura em ambos os moldes mestres de microencapsulação e molde mestre de dissociação para criar uma camada de 3-4 mm.
      NOTA: Uma mistura de 50 g de base de elastômero com 5 g de agente de cura é suficiente para cobrir um molde mestre com espessura de 3 mm.
   2. Coloque as placas de Petri contendo os moldes em um desiccador a vácuo por 15 minutos para desafosar o PDMS nãocurado.
   3. Mova as louças de Petri para um forno e leve ao forno a 80 °C por um mínimo de 60 min.
   4. Retire os moldes mestres do forno e deixe esfriar. Usando uma faca de precisão, corte cuidadosamente o PDMS seguindo a forma do wafer e retire as peças do PDMS do molde mestre.
   5. Corte as lajes PDMS aparando as bordas de cada dispositivo com um bisturi, em seguida, solve as portas fluidas de entrada/saída no dispositivo de dissociação e apenas no dispositivo microfluidic superior usando agulhas de aço inoxidável. Cubra os dispositivos com fita mágica para evitar contaminação.
      NOTA: O medidor de agulha é de 14 G e 15 G para portas de entrada e saída, respectivamente.
   6. Para a ligação, trate os lados padronizados das peças PDMS superior e inferior com plasma O₂ em um plasma etcher por 2 minutos.
   7. Alinhe ambas as peças de PDMS sob um estereoscópio depois de adicionar uma fina camada de separação de água destilada diretamente nos microcanais (2 μL).
   8. Coloque o dispositivo PDMS alinhado no forno a 80 °C durante a noite para completar a ligação e restaurar o PDMS ao seu estado hidrofóbico original. Armazene os dispositivos até que use mais.
      NOTA: Isso resulta em um dispositivo coaxial de foco de fluxo com três alturas diferentes de 120 μm para núcleo, 200 μm para shell e 300 μm para canais de óleo.
   9. A fim de usar o dispositivo logo após a ligação plasmática, injete cuidadosamente, mas firmemente, 30 μL de solução de revestimento hidrofóbico nos canais fluidos para alcançar o revestimento hidrofóbico. Em seguida, expurgue imediatamente o ar nos canais até que não sejam observados resíduos da solução de revestimento hidrofóbico no dispositivo.
   10. Conecte o dispositivo de dissociação tratando primeiro o lado padronizado do dispositivo e um vidro deslizante limpo com plasma O₂ por 2 minutos, e depois monte-os para uma maior cura no forno a 80 °C durante a noite.
       NOTA: Os dispositivos podem ser armazenados até que sejam usados.

2. Preparação de soluções

1. Soluções de estoque. Primeiro, prepare soluções de estoque (soluções concentradas) que serão diluídas para menores concentrações para uso real.
   NOTA: As soluções de estoque são usadas para economizar tempo de preparação, conservar materiais, reduzir o espaço de armazenamento e melhorar a precisão ao preparar uma solução de trabalho em concentrações mais baixas.
   1. Prepare 30 mL de solução núcleo 2x (16% PEG e 34% de massa gradiente de densidade): misture 4,8 g de 35 kDa PEG, 10,2 mL de mídia gradiente de densidade e 19,8 mL de mídia DMEM/F12. Filtre esta solução principal usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
   2. Prepare 50 mL de óleo mineral com 3% de surfactante: misture 48,5 mL de óleo mineral e 1,5 mL de surfactante. Mantenha-se em uma condição estéril após a filtragem através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
   3. Prepare 50 mL de óleo mineral com 0,5% de surfactante: misture 49,75 mL de óleo mineral e 0,25 mL de surfactante. Mantenha-se em uma condição estéril.
   4. Prepare 1 M Dithiotheritol (DTT): dissolva 1,5425 g de DTT em água destilada de 10 mL. Mantenha-se em uma condição estéril.
   5. Prepare 1 M Trietanolamina (TEA): adicione 66,4 μL de TEA em 433,6 μL de água destilada. Mantenha-se em uma condição estéril.
   6. Prepare 1% Pluronic F127 (PF127): dissolver 100 mg de PF127 em 10 mL de água destilada. Mantenha-se em uma condição estéril.
2. Soluções de trabalho
   1. Prepare uma emulsão crosslinker misturando 4,5 mL de óleo mineral com 3% de surfactante e 300 μL de 1 M DTT (razão de 1:15). Vórtice a solução para 2 min e sonicate por 45-60 min em um banho ultrassônico a 20 °C. Carregue esta solução para uma seringa de 5 mL com uma agulha de 27 G.
      NOTA: A emulsão é gerada pela mistura óleo/água sônica.
   2. Prepare a solução de óleo de blindagem carregando o óleo mineral com 0,5% de surfactante a uma seringa de 5 mL com uma agulha de 27 G.
   3. Prepare a solução shell (8% c/v PEG-4-Mal e 15 mM TEA) adicionando 32 mg de PEG-4-Mal em 400 μL de 1x DPBS para formar solução de 8% w/v, e vórtice da solução por 2 min. Em seguida, adicione 6 μL de 1 M TEA (concentração final de 15 mM TEA). Finalmente, centrífuga a 13.000 x g por 5 min através de um spin-filter e mantê-lo no escuro no roqueiro por 30 minutos. Em seguida, carregue esta solução para uma seringa de 1 mL com uma agulha de 27 G.
      NOTA: Deixe o recipiente PEG-4-Mal para sentar à temperatura ambiente por 10 minutos antes de abrir a tampa, e soprar gás N₂ para substituir o O₂ por N₂ antes de fechar a tampa. Vortex TEA antes de adicionar à solução.
3. Prepare a suspensão da célula na solução principal
   1. Trate os hPSCs com trippsina por 5 a 10 min a 37 °C. Então, recolham-nas das placas. Sacie a trippsina com o meio após o descolamento celular e, em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
   2. Centrifugar a suspensão da célula a granel (400 x g, 5 min). Aspire cuidadosamente o supernasce e, em seguida, resuspende a pelota celular usando um volume mínimo de meio de crescimento. Conte as células usando um contador automático de células.
      NOTA: As alíquotas típicas das células contêm células de 12-20 x 10⁶ e são suficientes para fazer 400 μL da solução principal.
   3. Pegue 12-20 x 10⁶ células da suspensão da célula a granel e centrifugar a suspensão celular/mídia (400 x g, 5 min).
   4. Aspirar cuidadosamente a mídia da pelota celular. Em seguida, adicione 200 μL de mídia e 200 μL de solução PEG 2x (concentração final 30-50 x 10⁶ células/mL) e misture suavemente.
      NOTA: Baixas concentrações celulares (menos de 20 x 10⁶ células/mL) resultaram em muitas cápsulas vazias.
   5. Adicione 30 μL de 1% PF127 à solução.
   6. Insira uma barra de micro agitador (2 mm x 7 mm) em uma seringa de 1 mL e, em seguida, carregue a célula contendo solução central para a seringa com uma agulha de 27 G. Mantenha a solução fria com gelo durante todo o processo de encapsulamento.

3. Configuração experimental

1. Coloque o dispositivo de gotícula PDMS ligado, quatro peças de 20 cm de comprimento e um pedaço de micro tubos de entrada de 5 cm de comprimento (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), um pedaço de tubo de saída de 10 cm (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.), e seis peças de tubos de 0,5 cm de encaixe (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) sob uma fonte de luz germicidal (tipicamente construída em armários de segurança biológica) e esterilizar para 30 Min.
2. Use fórceps para encaixar a tubulação nas portas fluidas de entrada e nas portas de dissociação.
3. Use as três peças de microtubos de entrada de 20 cm de comprimento para as entradas da casca, óleo, entradas de emulsão de crosslinker e uma peça para a entrada do dispositivo de dissociação. Em seguida, insira a extremidade oposta dos tubos à agulha da seringa com a solução correspondente. Enquanto isso, conecte a entrada central do dispositivo microfluido e a saída do dispositivo de dissociação com um microtubo de 5 cm (Figura 1C).
   NOTA: Os microtubos de entrada devem ser firmemente fixados dentro dos tubos de encaixe, que foram inseridos na última etapa.
4. Insira um tubo de saída na porta de saída fluida e coloque a extremidade oposta em um reservatório de coleta.
5. Coloque o dispositivo em um estágio de microscópio e conecte a tubulação para evitar se mover. Alinhe e concentre o microscópio no bocal do dispositivo para inspeção de fluxo.
6. Coloque cada seringa em diferentes bombas de seringa e fixe corretamente (Figura 1B). Programe cada bomba de acordo com os protocolos do fabricante para as seguintes taxas de fluxo: núcleo (3-5 μL/min), shell (3-5 μL/min), óleo de blindagem (20-80 μL/min) e óleo de crosslinking (40-60 μL/min). Inicie o fluxo em todas as bombas.
7. Aguarde que cada fluido entre no dispositivo e encha os canais enquanto empurra o ar restante.
   NOTA: Se houver uma grande quantidade de ar na tubulação de entrada, aumente temporariamente cada vazão até que o ar seja completamente removido. Tenha em mente que a taxa de fluxo excessiva pode levar à falha de títulos PDMS-to-PDMS.
8. Quando a formação da cápsula estiver estabilizada (Figura 3), coloque a extremidade oposta do tubo de coleta em um novo tubo cônico com 5 mL de mídia mTeSR.
   NOTA: A mídia contém inibidor rock de 10 μM, penicilina U/mL de 100 U/mL e estreptomicina de 100 μg/mL.
9. Após a coleta de um número suficiente de cápsulas, incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 10 min. As cápsulas residentes na fase do óleo estarão no topo do tubo (ver Figura 4A). Tocar suavemente no tubo faz com que as cápsulas se sedimentem até o fundo. Depois disso, a maior parte do petróleo e da mídia podem ser aspirados.
10. Recolher as cápsulas da parte inferior do tubo cônico, colocá-las em um coador de células (tamanho de poros de 100 μm) e lavar com quantidades abundantes de mídia. Em seguida, colete microcápsulas usando mídia de 2 mL em uma placa de cultura de 6 poços, executando a mídia através do filtro, pois ela é invertida em cima da placa de poço (ver Figura 4A).

4. cultura e análise hPSC em microcápsulas

1. Cultura básica
   1. Incubar as cápsulas de células-tronco em um prato de cultura de placa de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂.
   2. Mude a mídia a cada dois dias coletando as cápsulas em um filtro de coador de células, lavando-as com excesso de mídia e reutilizando-as para um novo poço em placas de 6 poços com mídia de 2 mL como foi feito na etapa 3.10.
   3. Cultue as cápsulas por pelo menos 10 dias.
2. Realize o ensaio vivo/morto para determinar a viabilidade das células-tronco encapsuladas.
   1. Descongelar soluções de ensaio ao vivo/morto (ethidium homodimer-1 e calcein AM).
   2. Adicione 4 μL do homodimer-1 e 1 μL de 4 μM calcein AM a 2 mL de DPBS estéreis. Vórtice para garantir a mistura completa.
   3. Colete aproximadamente 100 microcápsulas em um coador de células e enxágue-as com DPBS estéreis para permitir a difusão do meio fora das cápsulas.
   4. Colete-os novamente em uma placa de cultura de 12 poços usando 1 mL da solução preparada na etapa 4.2.2. Incubar a 37 °C por 20 min.
   5. Visualize as células sob um microscópio de fluorescência.
      NOTA: A viabilidade celular é quantificada pelo cálculo da porcentagem de células vivas, que são visualizadas como verdes, entre o número total de células.
3. Caracterização do tamanho de spheroid.
   1. Quando desejar, coloque a placa do poço com microcápsulas sob o microscópio e meça o diâmetro dos esferoides mostrados no software relacionado com barras de escala adequadas.
   2. Meça e analise o tamanho do esferoide.

Resultados

Seguindo o protocolo acima mencionado, o leitor poderá fabricar dispositivos microfluidos e produzir microcápsulas portadoras de células. A Figura 3A mostra exemplos de microcápsulas ótimas e subótimas fabricadas usando geração de gotículas microfluídicas. Diferentes formulações de PEG-4-Mal resultaram em cápsulas de morfologias variadas - cápsulas enrugadas estavam associadas à má gelação, baixa integridade mecânica e não resistivam ao cultivo em um bioreator mexido. Cá...

Discussão

O processo de encapsulamento descrito aqui resulta na formação reprodutível de esferoides hPSC. O formato de microcápsula facilita a distribuição de esferoides em poços de uma placa de microtítiter para experimentos que visam melhorar/otimizar protocolos de diferenciação ou testar terapias. Esferoides de células-tronco encapsuladas também podem ser usados em culturas de suspensões onde a concha de hidrogel protege as células contra danos induzidos por tesoura⁷.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filters	Genesee Scientific	25-244
1 ml syringe luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml syringe luer-lock tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
CAD software	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size	cardinal	335583
Chlorotrimethylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter	Life technology	A27974
Digital hot plate	Dataplate
Digital vortex mixer	Fisher Scientific	215370
Distilled water	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit	Fisher	L3224
Magic tape	Staples	483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro stir bar	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps	Fisher scientific	XX6200006P
Mineral oil	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge	CML supply	901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge	CML supply	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Oven	Thermo Scientific	HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)	Gemini	400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plasma Cleaning System	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silicon wafer 100mm	University Wafer	452
Slide glass (75mm ´ 25mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	2065622
Syringe pump	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triethanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μPG 101 laser writer	Heidelberg Instruments	HI 1128