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Resumo

Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método benéfico para medir fotofilosiologia fotossiológica II e produtividade primária. Aqui descrevemos um protocolo para medir a fotofisiologia PSII de algas epizoicas, Colacium sp. em zooplâncton substrato usando FRRf tipo cuvette.

Resumo

Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método benéfico para medir fotosiologia II (PSII) e produtividade primária. Embora a FRRf possa medir a seção transversal de absorção do PSII (σ PSII), eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm), eficiência fotoquímica eficaz (Fq′/Fm′) e saciamento não fotoquímico (NPQNSV) para várias algas eucarióticas e cianobactérias, quase todos os estudos frrf até o momento se concentraram em fitoplâncton. Aqui, o protocolo descreve como medir a fotofisiologia psii de uma alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), em seu estágio anexo (ligado ao zooplâncton), usando FRRf tipo cuvette. Primeiro, estimamos os efeitos do zooplâncton substrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) na fluorescência da linha de base e σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′, e NPQNSV de Colacium planctônico sp. Para validar essa metodologia, foram registradas medições fotofisiologia do Colacium sp. anexado em S. mucronata e comparamos esses resultados com sua fase planctônica. Resultados representativos mostraram como o protocolo poderia determinar os efeitos do cálcio (Ca) e manganês (Mn) na fotofisiologia de Colacium sp. e identificar os diversos efeitos do enriquecimento de Mn entre estágios ligados e plantônicos. Finalmente, discutimos a adaptabilidade deste protocolo a outras algas perifitárias.

Introdução

A fluorescência variável de clorofila é uma ferramenta útil para medir a fotofilosiologia alcanela II (PSII). As algas respondem a diversos estresses ambientais, como excesso de luz e deficiência de nutrientes, alterando sua fotofisiologia PSII. Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método comum para medir a fotofisiologia PSII1,2 e estimar a produtividade primária1,3,4, o que permite monitorar a fotofisiologia fitoplâncton PSII, bem como a produtividade primária em larga escala espacial e temporal5,6,7. A FRRf pode medir simultaneamente a seção transversal de absorção do PSII (σ PSII), concentração do centro de reação ([RCII]), eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm), eficiência fotoquímica eficaz (Fq'/Fm′) e saciamento não fotoquímico (NPQNSV) (Tabela 1). Em geral, Fv/Fm e Fq'/Fm′ são definidos como atividade PSII8, enquanto NPQNSV é definido como energia relativa dissipada pelo calor9.

É importante ressaltar que os flashes de rotatividade única (ST) de FRRf reduzem totalmente o principal aceitador de elétrons de quinone, QA, mas não a piscina de plastoquinona. Por outro lado, vários flashes de rotatividade (MT) a partir de um fluorômetro de modulação de amplitude de pulso (PAM) podem reduzir ambos. O método ST tem uma clara vantagem sobre o método MT ao identificar as possíveis origens do NPQNSV, medindo simultaneamente cinéticas de recuperação de Fv/Fm, Fq'/Fm′, NPQNSV e σ PSII10. Até o momento, vários tipos de instrumentos FRRf, como tipo submersível, tipo cuvette e fluxo através do tipo, estão disponíveis comercialmente. O FRRf do tipo submersível permite medições in situ em oceanos e lagos, enquanto o FRRf do tipo cuvette é adequado para medir pequenos volumes de amostra. O tipo de fluxo é comumente usado para medir continuamente a fotofisiologia do fitoplâncton em águas superficiais.

Dado o desenvolvimento de fluorômetros PAM, incluindo o tipo cuvette, para uma ampla gama de indivíduos11, fluorômetros PAM ainda são mais comuns do que FRRfs em pesquisa de fotofisiologia alga ágala12. Por exemplo, embora a estrutura da câmara de amostra e a capacidade de cuvette entre essas ferramentas só diferem ligeiramente, o PAM tipo cuvette foi aplicado aos fitoplânctons13,14,15, microalgas benthic16,17,18, algas de gelo19 e algas epizoicas20, enquanto a FRRf tipo cuvette foi aplicada principalmente aos fitoplânctons21,22,23 e um número limitado de comunidades algas de gelo24,25. Dada a sua eficácia, a FRRf do tipo cuvette é igualmente aplicável às algas benthic e epizoicas. Portanto, a expansão de sua aplicação fornecerá uma visão considerável da fotofisiologia psii, particularmente para fotofisiologia de algas epizoicas menos conhecidas.

As algas epizoicas têm recebido pouca atenção, com poucos estudos examinando sua fotofisiologia PSII20,26, provavelmente devido a seus papéis menores em teias de alimentos aquáticos27,28. No entanto, epibiontes, incluindo algas epizoicas, podem influenciar positivamente a dinâmica da comunidade zooplâncton, como o aumento das taxas de reprodução e sobrevivência29,30, bem como processos de impacto negativo, como o aumento da taxa de afundamento29,31 e a vulnerabilidade aos predadores visuais32,33,34,35,36 . Por isso, é fundamental explorar os fatores ambientais e biológicos que controlam a dinâmica dos epibiontes nas comunidades zooplânctons.

Entre as algas epizoicas, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) é um grupo comum, de água doce, alga32,37,38,39 com várias fases de vida, incluindo anexado (Figura 1A-D), planktônico não motile (Figura 1E,F) e estágios plantônicos motile40,41 . Durante o estágio plantônico não motil, as células vivem como plânctons unicelulares, colônias agregadas, ou colônias de folhas de uma camada, cobertas por mucilage42. No estágio anexo, Colacium sp. utiliza mucilagem excretada da extremidade anterior da célula37,39,41 para anexar a organismos substratos (basibionts), particularmente microcrustaceanos41,43. Seu ciclo de vida também envolve se separar do exoesqueleto derretido ou basibiont morto e nadar com sua flagela para encontrar outro organismo substrato39. Ambos os estágios planctônicos e anexados podem aumentar seu tamanho populacional por mitose40. Embora seu estágio anexado seja considerado um traço evolutivo para a coleta de recursos, como a luz44 e os elementos de rastreamento41,45,46, ou como estratégia de dispersão27, poucas evidências experimentais estão disponíveis sobre esses aspectos37,41,44 e os mecanismos-chave de apego são amplamente desconhecidos. Por exemplo, Rosowski e Kugrens esperavam que Colacium obtenha manganês (Mn) de copepods substratos41, concentrados no exoesqueleto47.

Aqui, descrevemos como medir a fotofisiologia PSII das algas planctônicas e o método de aplicação relacionado para segmentação de algas anexadas (anexando ao zooplâncton) com células colacium sp. usando a FRRf tipo cuvette. Utilizamos o sistema Act2 equipado com três diodos emissores de luz (LEDs) que fornecem energia de excitação flash centrada em 444 nm, 512 nm e 633 nm48. Aqui, 444 nm (azul) corresponde ao pico de absorção de cromofila a (Chl-a), enquanto 512 nm (verde) e 633 nm (laranja) correspondem aos picos de absorção de ficoerthrina e ficocyanina, respectivamente. O pico de detecção de sinal fluorescente é de 682 nm com largura de banda de 30 nm. Como é difícil encontrar a etapa planctônica do Colacium sp. em ambientes naturais, seu estágio anexo foi coletado para os experimentos. Entre os numerosos organismos substratos, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figura 1A,B,G) é uma das mais simples de manusear devido à sua velocidade de natação lenta, grande tamanho do corpo (400-650 μm) e comportamento único (pendurado de cabeça para baixo na superfície da água). Portanto, este protocolo utiliza o Colacium sp. anexado em S. mucronata como um estudo de caso do sistema Colacium-basibiont. Para evitar fluorescência derivada do conteúdo intestinal, S. mucronata estava faminta. Como um estudo anterior relatou que o sinal de fluorescência do conteúdo intestinal (algas ingeridas) apresenta uma redução de cinco vezes após 40 min49, esperávamos que 90 min de fome fossem suficientes para minimizar a possibilidade de fluorescência do conteúdo intestinal afetando a medição da FRRf com efeitos mínimos de estresse experimental para Colacium sp., como deficiência de nutrientes. Além disso, este protocolo foi aplicado para esclarecer o mecanismo de anexação do Colacium sp. e determinar como dois metais, cálcio (Ca) e manganês (Mn) afetam a fotofisiologia tanto de estágios planctônicos quanto anexados. O cálcio desempenha papéis-chave nas vias fotossintéticas50 de várias maneiras, e ambos os metais são necessários para construir os complexos em evolução de oxigênio do PSII51. Como o cálcio e o manganês são altamente concentrados na carapaça do zooplâncton 47, temos a hipótese de que a fotofisiologia de Colacium sp. pode responder com mais destaque ao enriquecimento de Ca e Mn durante a fase planctônica se esta fase de vida obter esses elementos de S. mucronata durante a fase anexada.

Protocolo

1. Amostragem

  1. Recolher água do lago da superfície por um balde. Para atingir Colacium sp. anexado ao filtro S. mucronata (Figura 1A-C) 0,5-10 L de água do lago usando uma rede de malha de nylon de 100 μm52.
    NOTA: S. mucronata muitas vezes agregado densamente em águas rasas, eutróficas, lamacentas, como entre as áreas de reed (phragmites).
  2. Armazene as amostras concentradas em garrafas plásticas de 500 mL com 350 mL de água do lago. Mantenha-se em condições escuras.
  3. No laboratório, despeje a água da amostra em um béquer de 500 mL e deixe que ela se acomode por alguns minutos.
  4. Filtre a água do lago através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 μm.
  5. Pegue S. indivíduos de mucronata usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação. Realizar a identificação das espécies de acordo com Błędzki e Rybak53.
  6. Transfira-os para uma gota de 0,2-μm de água filtrada do lago (FLW) colocada em um escorregador de vidro.
    NOTA: S. mucronata pode nadar até a superfície ou se prender à parede do béquer.
  7. Verifique s. mucronata sob microscopia leve.
  8. Lave S. indivíduos de mucronata usando FLW (3 gotas ou mais) para evitar contaminação de outros organismos (Figura 2).
  9. Mantenha S. mucronata a uma temperatura in situ em uma câmara de crescimento sob 40 μmol fóton·m−2·s−1.

2. Efeitos de S . mucronata na fluorescência da linha de base

  1. S. cultivo de mucronata
    1. Pegue indivíduos de S. mucronata usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação e lave usando FLW, como na etapa 1.8.
    2. Aerate água da torneira usando uma bomba de ar elétrica através de uma pedra de ar por pelo menos 1 semana. Despeje 300 mL de água aerada da torneira em um frasco de vidro de 350 mL.
    3. Alimente chlorella (1 mg C·L−1) e mantenha a 20 °C sob 40 μmol fóton·m−2·s−1 em uma câmara de crescimento.
    4. Após aproximadamente 14 dias, pegue 5-30 indivíduos usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação e inocula-os em 300 mL de água limpa e arejada da torneira para manter o meio fresco.
  2. Configuração de FRRf
    1. Inicie o software Act2Run.
    2. Clique na guia Opções e selecione Act2 FLC (LEDs brancos) em Modo de Operação para definir a cor de LEDs actínicos.
    3. Clique no valor de Escuro na etapa 1 das configurações da curva de luz fluorescente na janela principal e digite 30 para definir a duração do período escuro (Figura 3A).
    4. Clique na combinação LED B, C e D para desligar os LEDs verde e laranja (Figura 3C).
    5. Clique no valor de Fets e Pitch sob sat, e tipo 100 e 2, respectivamente, para definir o número e o tom de flashlet na fase de saturação (Figura 3D).
    6. Clique no valor de Fets e Pitch sob Rel, e tipo 40 e 60, respectivamente, para definir o número e o tom de flashlet na fase de relaxamento (Figura 3E).
    7. Ative a bomba da capa de água clicando em Durante FLC (Figura 3F) para controlar a temperatura da amostra durante a medição.
    8. Ative clicando em Auto-LED e Auto-PMT (Figura 3F).
    9. Clique em Sincronizar para conectar FRRf-Act2.
  3. Medições frrf
    1. Para examinar os efeitos dos indivíduos zooplânctons na fluorescência da linha de base, prepare o S adulto. mucronata (tamanho corporal 400-650 μm) da cultura nas etapas 2.1.1-2.1.4 sem organismos ligados.
    2. Para evitar fluorescência do conteúdo intestinal, esflaçam os indivíduos em FLW a 20°C por pelo menos 90 minutos.
    3. Despeje 1,5 mL de FLW em uma cuvette. Pegue 0, 1, 5 e 10 indivíduos de mucronata s. usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação.
    4. Transferência S. mucronata indivíduos no cuvette e adicionar FLW para trazer a amostra até 2 mL.
    5. Aclimato sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) a 20 °C por 15 min antes da medição da FRRf.
    6. Clique no Act2 Run para iniciar a medição. Repita as medidas >3 vezes por amostra.
    7. Leia o valor fo da parcela de resultado (Figura 4).

3. Efeitos do organismo substrato em Chl- uma fluorescência

  1. Cultivo de Colacium sp.
    1. Prepare o FLW e o MÉDIO AF-654 para cultivo (Tabela 2).
    2. Recolher Colacium sp. anexado a S. mucronata como nas etapas 1.1 e 1.2 e, manter em temperatura in situ em uma câmara de crescimento.
    3. Pegue Colacium sp. com uma carapaça derretida (Figura 1D) usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação. Lave-os com FLW, como na etapa 1.8.
    4. Asepticamente inoculado Colacium sp. e meio AF-6 em um tubo de vidro de 10 mL em um banco limpo.
    5. Mantenha a cultura em temperatura in situ abaixo de 200 μmol fóton·m−2·s−1 em uma câmara de crescimento. Agite o tubo de vidro suavemente à mão pelo menos uma vez por dia para evitar a liquidação celular.
      NOTA: Para manter o efeito de atenuação das colônias agregadas o mais baixo possível, verifique as colônias sob um microscópio antes da medição da FRRf. A agregação celular pode causar colônias densas e afetar a fotofisiologia alga55.
  2. Medições frrf
    1. Para examinar os efeitos dos indivíduos zooplânctons em Chl-a fluorescência de Colacium sp., preparem s adultos. mucronata (tamanho corporal 400-650 μm) sem qualquer organismo ligado.
    2. Para evitar fluorescência do conteúdo intestinal, esfurre os indivíduos na FLW por pelo menos 90 minutos.
    3. Configure um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette (FRRf).
    4. Despeje um subsample de 1,5 mL de Colacium sp. pré-esculpido em uma cuvette. Transferência 0, 5, 10 e 15 S. mucronata indivíduos nestas cuvetas e adicionar 2 μm de meio filtrado para trazer a amostra até 2 mL.
    5. Aclimatar sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) a 20 °C por 15 minutos antes de tomar a medição frf.
      NOTA: Mantenha as amostras em temperatura de incubação durante as medições
    6. Clique no Act2 Run para iniciar a medição. Repita as medidas >3 vezes por amostra.
    7. Leia os valores de FO e Fm do gráfico de resultados (Figura 4).
      NOTA: Verifique o valor de RσPSII (Tabela 1), que mostra se a potência LED está dentro do intervalo ideal para estimar corretamente os parâmetros psii. Quando o Auto-LED é ativado, o sistema Act2run controla a potência LED para alcançar uma faixa RσPSII ótima (0.042-0.064). O valor de corte experimental de RσPSII foi definido em 0,03 e 0,08 em estudo anterior48.
    8. Para corrigir a fluorescência da linha de base22, filtrar o meio de cultura usando um filtro de tamanho de poros de 0,2 μm e medir a fluorescência. Subtrair FO da amostra de linha de base de FO e Fm de Colacium sp., ou modificar o valor de correção em branco nas configurações da guia Opções.

4. Fotofisiologia de Colacium sp. (estágio anexo)

  1. Isole indivíduos de S. mucronata com Colacium sp. usando uma pipeta sob um microscópio óptico.
  2. Lave S. mucronata usando FLW, como na etapa 1.8.
  3. Transferência S. mucronata em um 100 mL de FLW. Para a fome, mantenha-se sob condições escuras em temperatura in situ por 90 minutos.
  4. Despeje 1,5 mL de FLW em uma cuvette.
  5. Transferência ~10 S. mucronata indivíduos com Colacium sp. em uma cuvette. Para as medições, são necessárias mais de 100 células de Colacium por 2 mL. Adicione FLW para levar a amostra até 2 mL.
  6. Aclimatar sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) em temperatura in situ por 15 min. Medida Chl-a fluorescência como nas etapas 3.2.6-3.2.8.
  7. Para enumerar o número de células anexadas, fixar a amostra com glutaraldeído (volume final de 2%) após a medição da FRRf. Tire fotos em várias profundidades focais e posições de S. mucronata sob um microscópio leve.

5. Fotofisiologia de Colacium sp. (estágio planctônico)

  1. Cultivar colacium amostrado sp. em média AF-6 em temperatura in situ como nas etapas 3.1.1-3.1.5.
  2. Para a fase estacionária, pegue 2 mL de Colacium sp. cultivado e despeje em uma cuvette.
  3. Aclimatar sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) em temperatura in situ por 15 min. Medida Chl-a fluorescência como nas etapas 3.2.6-3.2.8.

6. Efeitos da adição de Ca e Mn na fotofisiologia de Colacium sp.

  1. Efeitos no estágio anexado
    1. Isole indivíduos de S. mucronata com Colacium sp. usando uma pipeta sob um microscópio óptico. Lave usando FLW, como na etapa 1.8.
    2. Transfira seis indivíduos cada um em 12 copos de vidro com 30 mL de FLW. Certifique-se de que cada béquer contém células de >100 Colacium sp.
    3. Adicionar 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamento ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (tratamento Mn), ou água ultrauso (controle) para cada béquer. Incubar as amostras sob 200 μmol fóton·m−2 ·s−1 em temperatura in situ em uma câmara de crescimento.
    4. Às 3h e 21h, transfira todos os indivíduos e peles fundidas em uma cuvette com 2 mL do meio.
    5. Para examinar a resposta rápida ao aumento da luz, clique em Up dos períodos de 8 passos de luz actínica e tipo 20 (Figura 3A) para definir a duração de cada etapa em 20 s. Para definir a luz actínica stepwise como 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 e 200 μmol fóton·m−2·s−1, clique em High E e Step Up e altere os valores para 200 e 34, respectivamente (Figura 3B).
    6. Após 15 minutos de aclimatação escura, meça a fluorescência chl-a de cada amostra semelhante aos passos 3.2.6-3.2.8.
      NOTA: Verifique se os valores RσPSII e RσPSII estão dentro da faixa ideal (0,03-0,08)48.
  2. Efeitos no estágio planctônico
    1. Cultivar colacium amostrado sp. em média AF-6 em temperatura in situ como nas etapas 3.1.1-3.1.5.
    2. Transfira o cultura colacium sp. para FLW e aclimatar a temperatura in situ inferior a 200 μmol fóton·m−2·s−1 por 3 dias.
    3. Transfira 1 mL das amostras aclimatadas em três frascos de vidro com 10 mL de FLW.
    4. Adicionar 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamento ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (tratamento Mn), ou água ultrauso (controle) para frascos. Incubar as amostras sob 200 μmol fóton·m−2·s−1 em temperatura in situ em uma câmara de crescimento.
    5. Às 3h e 21h, meça a fluorescência chl-a de cada amostra como nas etapas 3.2.6-3.2.8.

Resultados

Não houve efeito significativo da fluorescência da linha de base (Figura 5) ou flauscência chl-a (Figura 6) por S. mucronata até 5 indivíduos (inds.) mL−1. No entanto, Fv/Fm e NPQNSV foram significativamente afetados quando a mucronata de S. foi de 7,5 inds·mL−1. Portanto, para medir a fotofisiologia de Colacium sp. durante a fase anexa...

Discussão

Este protocolo demonstrou pela primeira vez que a fotofisiologia de Colacium sp. durante a fase anexa em um ambiente natural é comparável à sua etapa planctônica no meio AF-6. Além disso, o conteúdo intestinal da esfomeada S. mucronata não afetou a linha de base e a fluorescência chl-a quando a densidade foi ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 e Figura 6). Esses resultados sugerem que este protocolo pode medir a fotofisiolog...

Divulgações

Os autores não têm revelações para declarar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa Colaborativa da Prefeitura de Shiga intitulado "Estudo sobre a qualidade da água e meio ambiente no fundo do lago para a proteção da solidez do ambiente hídrico" sob a Concessão Japonesa de Revitalização Regional e o Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento De Tecnologia ambiental (nº 5-1607) do Ministério do Meio Ambiente, Japão. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Os autores gostariam de agradecer a Enago (www.enago.jp) pela revisão da língua inglesa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrodisc syringe filterPall Corporation, Ann Arbor, MI, USA0.2 μm pore size
Act2RunCTG Ltd., West Molesey, UK
BiotinWako023-08711AF-6 medium
CaCl2·2H2OWako031-25031AF-6 medium
CaCO3Wako036-00382AF-6 medium
Citric acidWako036-05522AF-6 medium
CoCl2·6H2OWako036-03682AF-6 medium
Concentrated ChlorellaRecenttec, Tokyo, Japan20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrateWako093-00952AF-6 medium
FeCl3·6H2OWako091-00872AF-6 medium
HCLP-880PFNippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		With LED light bulbs
K2HPO4Wako160-04292AF-6 medium
KH2PO4Wako167-04241AF-6 medium
MgSO4·7H2OWako137-00402AF-6 medium
MnCl3·4H2OWako139-00722AF-6 medium
Na2EDTAWako343-01861AF-6 medium
Na2MoO4Wako196-02472AF-6 medium
NaNO3Wako191-02542AF-6 medium
NH4NO3Wako015-03231AF-6 medium
Plankton CounterMatsunami Glass, Osaka, JapanS6300
Pylex test tubeCTG Ltd., West Molesey, UKWith rim, 16 x 100 mm
Vit. B1Wako203-00851AF-6 medium
Vit. B12Wako226-00343AF-6 medium
Vit. B6Wako165-05401AF-6 medium
ZnSO4·7H2OWako264-00402AF-6 medium

Referências

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