Subcultura e Criopreservação de Organoides Adenocarcinoma Esofágico: Prós e Contras para Digestão Celular Única

Resumo

Este protocolo descreve os métodos de subcultura e criopreservação de organoides adenocarcinoma esofágico com e sem digestão celular única para permitir que os pesquisadores escolham estratégias apropriadas com base em seu desenho experimental.

Resumo

A falta de modelos de pesquisa translacional adequados que refam doenças primárias para explorar a tumorigênese e estratégias terapêuticas é um grande obstáculo no adenocarcinoma esofágico (EAC). Organoides derivados do paciente (PDOs) surgiram recentemente como um modelo pré-clínico notável em uma variedade de cânceres. No entanto, ainda há protocolos limitados disponíveis para o desenvolvimento de PDOs EAC. Uma vez estabelecidos os PDOs, a propagação e a criopreservação são essenciais para novas análises a jusante. Aqui, dois métodos diferentes foram padronizados para subcultura e criopreservação de PDOs EAC, ou seja, com e sem digestão celular única. Ambos os métodos podem obter de forma confiável a viabilidade celular apropriada e são aplicáveis para uma configuração experimental diversificada. O presente estudo demonstrou que subculturar PDOs EAC com digestão celular única é adequado para a maioria dos experimentos que requerem controle de número de células, densidade uniforme e uma estrutura oca que facilita o rastreamento de tamanho. No entanto, o método baseado em células únicas mostra um crescimento mais lento na cultura, bem como após o reap cultivo de estoques congelados. Além disso, subcultura com digestão celular única é caracterizada pela formação de estruturas ocas com um núcleo oco. Em contrapartida, processar PDOs EAC sem digestão celular única é favorável para criopreservação, expansão e caracterização histológica. Neste protocolo, as vantagens e desvantagens da subcultura e criopreservação de PDOs EAC com e sem digestão celular única são descritas para permitir que os pesquisadores escolham um método adequado para processar e investigar seus organoides.

Introdução

O câncer de esôfago (CE) é a décima causa mais comum e a sexta principal causa de morte por câncer em todo o mundo¹. O adenocarcinoma esofágico (EAC) é um dos principais subtipos histológicos da CE e ocorre principalmente nos países ocidentais². Na última década, a incidência do EAC aumentou significativamente em muitos países desenvolvidos, incluindo a Alemanha³. Devido à agressividade do câncer e à falta de sintomas durante o estágio inicial do desenvolvimento do tumor, o prognóstico geral em pacientes com EAC é ruim, mostrando uma taxa de sobrevivência de 5 anos de cerca de 20%

Protocolo

Uma cultura PDO estabelecida e bem crescente representa a base para uma subcultura e criopreservação bem sucedida descritas neste protocolo. Aqui, os PDOs do EAC foram gerados a partir do tecido tumoral primário dos pacientes da EAC usando o protocolo descrito por Karakasheva T. A. et al¹⁷. Os tecidos EAC foram coletados do biobanco sob a aprovação do BioMaSOTA (aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Colônia, ID: 13-091).

NOTA: Os PDOs do EAC foram cultivados em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂ utilizando um meio de cultura PDO (Tabela 1). Nas etapas seguintes, dois....

Resultados

Este protocolo apresenta os procedimentos que incluem subcultura e criopreservação de PDOs EAC com e sem digestão celular única.

A Figura 1 mostra imagens representativas de contraste de fase das duas estratégias diferentes de subcultura. Os PDOs do EAC atingiram densidade adequada para subcultura (Figura 1, à esquerda). Subcultura sem digestão celular única leva menos tempo para atingir densidade comparável e leva principalm.......

Discussão

Neste protocolo, são descritos dois métodos diferentes de subcultura e criopreservação de PDOs EAC, ou seja, com e sem digestão celular única. Vários estudos recomendaram a passagem de PDOs EAC com digestão^{celular única 15,17}, o que é benéfico para a maioria dos experimentos que requerem controle de número de células, densidade uniforme e uma estrutura oca que facilita o rastreamento de tamanho. No entanto, o método baseado em célula única é cara.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503