Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Resumo

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Resumo

Os recentes avanços no software de instrumentação e processamento de imagens tornaram a microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) o método preferido para biólogos estruturais determinarem estruturas de alta resolução de uma grande variedade de macromoléculas. Vários pacotes de software estão disponíveis para usuários novos e experientes para processamento de imagens e cálculo de estrutura, que simplificam o mesmo fluxo de trabalho básico: filmes adquiridos pelos detectores de microscópio passam por correção para estimativa da função de transferência de movimento e contraste (CTF) induzida pelo feixe. Em seguida, as imagens de partículas são selecionadas e extraídas de quadros de filme medianos para classificação iterativa 2D e 3D, seguidas de reconstrução 3D, refinamento e validação. Como vários pacotes de software empregam algoritmos diferentes e exigem diferentes níveis de experiência para operar, os mapas 3D que eles geram muitas vezes diferem em qualidade e resolução. Assim, os usuários transferem regularmente dados entre uma variedade de programas para obter resultados ideais. Este artigo fornece um guia para que os usuários naveguem em um fluxo de trabalho através dos pacotes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma estrutura de resolução quase atômica do vírus associado ao adeno (AAV). Primeiro detalhamos um pipeline de processamento de imagem com o crioSPARC v3, pois seus algoritmos eficientes e gui fácil de usar permitem que os usuários cheguem rapidamente a um mapa 3D. Na etapa seguinte, usamos pyem e scripts internos para converter e transferir coordenadas de partículas da melhor reconstrução 3D de qualidade obtida em crioSPARC v3 para RELION-3 e Scipion 3 e recalcular mapas 3D. Finalmente, delineamos etapas para maior refinamento e validação das estruturas resultantes, integrando algoritmos do RELION-3 e Scipion 3. Neste artigo, descrevemos como utilizar efetivamente três plataformas de processamento para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados para determinação de estrutura de alta resolução.

Introdução

A microscopia crio-elétron (crio-EM) e a análise de partículas únicas (SPA) permitem a determinação da estrutura de uma grande variedade de conjuntos biomoleculares em seu estado hidratado, ajudando a iluminar os papéis dessas macromoléculas em detalhes atômicos. Melhorias na óptica de microscópio, hardware de computador e software de processamento de imagens tornaram possível determinar estruturas de biomoléculas em resolução que ultrapassassem 2 ^Å1,2,3. Mais de 2.300 estruturas crio-EM foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) em 2020, em comparação com 192 estruturas em....

Protocolo

1. Criação de um novo projeto crioSPARC v3 e importação de dados

NOTA: Os dados foram adquiridos na Oregon Health and Science University (OHSU) em Portland usando um microscópio eletrônico Titan Krios de 300 kV equipado com um detector de elétrons direto Falcon 3. As imagens foram coletadas em um modo de contagem com uma dose total de 28,38 e⁻/^Å2 fracionados em 129 quadros, e uma faixa de desfocus de -0,5 μm a -2,5 μm, a um tamanho de pixel de 1.045 Å usando EPU. A amostra de AAV-DJ foi fornecida pela equipe da OHSU.

1. Abra o crioSPARC v3 em um navegador da Web e clique no cabeçalho Pro....

Resultados

Apresentamos um pipeline SPA abrangente para obter uma estrutura de alta resolução usando três plataformas de processamento diferentes: crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3. As figuras 1 e figura 4 resumem o fluxo de trabalho geral de processamento e a Tabela 1 detalha os protocolos de refinamento. Estes protocolos foram usados durante refinamentos de uma estrutura de 2,3 Å de AAV, alcançando perto da resolução nyquist.

Discussão

Neste artigo, apresentamos um fluxo de trabalho ROBUSTO spa para processamento de dados crio-EM em várias plataformas de software para alcançar reconstruções 3D de alta resolução (Figura 1). Este fluxo de trabalho é aplicável a uma grande variedade de macromoléculas biológicas. As etapas subsequentes do protocolo estão descritas na Figura 4, incluindo pré-processamento de filmes, coleta e classificação de partículas e múltiplos métodos para refi.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/