Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Resumo

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Resumo

A capacidade de visualizar interações fisiológicas complexas e dinâmicas entre numerosos tipos de células e a matriz extracelular (ECM) dentro de um microambiente tumoral vivo é um passo importante para entender mecanismos que regulam a progressão do tumor. Embora isso possa ser realizado através das técnicas atuais de imagem intravital, ela permanece desafiadora devido à natureza heterogênea dos tecidos e à necessidade de contexto espacial dentro da observação experimental. Para isso, desenvolvemos um fluxo de trabalho de imagem intravital que emparelha a imagem de segunda geração harmônica de colágeno, fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H, e microscopia de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) como meio de compartimentar não invasivamente o microambiente tumoral do tumor em domínios básicos do ninho tumoral, o estroma circundante ou ECM, e a vaculatura. Este protocolo não invasivo detalha o processo passo a passo que vai desde a aquisição de imagens de lapso de tempo de modelos de tumores mamários até análise pós-processamento e segmentação de imagens. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele explora assinaturas metabólicas para contextualizar o microambiente tumoral vivo em mudança dinâmica sem o uso de rótulos fluorescentes exógenos, tornando-o vantajoso para modelos de xenerto derivados do paciente humano (PDX) e uso clínico futuro onde fluoroforos extrínsecos não são prontamente aplicáveis.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) no microambiente tumoral é conhecida por ser dinamicamente depositada e remodelada por múltiplos tipos de células para facilitar ainda mais a progressão da doença ^1,2,3. Essas alterações matriciais fornecem sinais mecânicos e biológicos que alteram o comportamento celular e muitas vezes resultam em um ciclo contínuo de remodelação matricial⁴. A investigação sobre a interação dinâmica e recíproca entre as células tumorais e a matriz extracelular é frequentemente conduzida usando cultura tridimensional (3D) in vitro ou sistemas microfluidos. Embora essas abordagens de baixo para cima tenham demonstrado mecanismos de remodelação do ECM ^5,6,7, aumento da proliferação⁸, epitelial para transição mesenquimal ^9,10,11,12, e migração e invasão de células tumorais 7,13,14,15,16 , seu foco tem sido principalmente em alguns tipos de células (por exemplo, células tumorais ou fibroblastos) dentro de uma matriz 3D homogênea em comparação com a diversidade e heterogeneidade das interações presentes dentro de um tecido fisiológico. Além dos sistemas in vitro, a histologia tumoral ex vivo também pode fornecer algumas informações sobre essas interações célula-célula e célula-ECM¹⁷. A imunohistoquímica tem a vantagem de poder analisar múltiplos tipos celulares no que diz respeito à composição espacialmente heterogênea e arquitetura do ECM, mas os pontos finais estáticos do tecido fixo não captam a natureza dinâmica das interações entre as células e o microambiente. A imagem intravital abriu a porta para interrogar interações diversas e dinâmicas dentro do contexto fisiológico do microambiente tumoral nativo.

As capacidades de imagem de tumor intravital estão avançando rapidamente. Melhorias no design de janelas de imagem e técnicas cirúrgicas para implantar as janelas permitiram imagens longitudinais de tumor a longo prazo em uma variedade de locais anatômicos (ou seja, tumor primário, linfonodos, sítios metastáticos 18,19,20). Além disso, a capacidade de instrumentação óptica para visualizar e coletar dados em múltiplas dimensões (ou seja, intensidade espectral, fluorescência espacial e vida útil), e em alta resolução e velocidade (taxa de vídeo) está se tornando amplamente acessível. A tecnologia aprimorada oferece uma oportunidade para explorar mudanças rápidas na sinalização celular e dinâmica fenotípica dentro de um ambiente fisiológico. Por fim, a expansão das ferramentas optogenéticas e a ampla gama de construções fluorescentes genéticas permitem a marcação de tipos celulares específicos para capturar a migração celular no microambiente tumoral ou rastreamento de linhagem celular durante o desenvolvimento ou progressão da doença^21,22. O uso dessas ferramentas em combinação com a tecnologia CRISPR/Cas9 proporciona aos pesquisadores a oportunidade de gerar modelos animais únicos em tempo hábil.

Embora todos esses avanços tornem a imagem intravital um método cada vez mais poderoso para explorar interações celulares dinâmicas e fisiológicas, ainda há uma necessidade importante de desenvolver estratégias que forneçam contexto espacial, temporal e estrutural no nível tecidual a essas interações biológicas. Atualmente, muitos estudos de imagem intravital compensam a falta de marcos visuais, como os vasos sanguíneos, injetando corantes fluorescentes na vasculatura ou empregando modelos de camundongos que exógenos expressam proteínas fluorescentes para delinear características físicas. Corantes injetáveis e substratos como dextrans fluorescentes são amplamente utilizados para rotular com sucesso a vasculatura nas coleções intravitais^{19, 23, 24}. No entanto, essa abordagem não é sem limitações. Por um tempo, requer manipulações adicionais de mouse e sua utilidade está limitada a experimentos de curto prazo. Para estudos longitudinais, o dextran fluorescente pode ser problemático, pois observamos o acúmulo de dextran em células fagocíticas ou difusão no tecido circundante ao longo do tempo²⁵. A incorporação de proteínas fluorescentes exógenas no modelo do camundongo tem sido apresentada como uma alternativa aos dextrans fluorescentes, mas apresenta limitações próprias. A disponibilidade e a diversidade de fluoroforos exógenos dentro dos modelos de mouse ainda são limitadas e caras de criar. Além disso, em modelos específicos, como modelos PDX, manipulações genéticas não são desejáveis ou possíveis. Também foi demonstrado que a presença de proteínas fluorescentes ou bioluminescentes dentro das células são reconhecidas como estrangeiras dentro do camundongo, e dentro de modelos de camundongos imunocompetuntes, isso reduz a quantidade de metástase devido à resposta do sistema imunológico hospedeiro^26,27. Por fim, proteínas fluorescentes exógenas ou corantes fluorescentes usados para contexto espacial ou para segmentar dados subsequentes muitas vezes ocupam faixas primos do espectro de luz que poderiam ser usadas para investigar as interações fisiológicas de interesse.

O uso do sinal intrínseco do ECM ou fluorescência endógena das células dentro do tecido representa um potencial meio universal livre de rótulos para segmentar dados intravitais para uma análise celular e espacial mais aprofundada. A segunda geração harmônica (SHG) tem sido usada há muito tempo para visualizar o ECM²⁸. Com o desenvolvimento subsequente de importantes ferramentas para auxiliar na caracterização da organização de^fibras 29,30,31, é possível caracterizar o comportamento celular em relação à estrutura local de ECM. Além disso, a autofluorescência do metabólito endógeno, NAD(P)H, fornece outra ferramenta sem rótulos para compartimentar o microambiente tumoral in vivo. Nad(P)H fluoresce brilhantemente em células tumorais e pode ser usado para discriminar os limites do ninho tumoral em crescimento de seu estroma circundante^21,32. Por fim, a vasculatura é uma importante estrutura fisiológica no microambiente tumoral e local de interações específicas do tipo celular chave 33,34,35. A excitação dos glóbulos vermelhos (RBC) ou plasma sanguíneo tem sido usada para visualizar a vasculatura tumoral, e usando excitação de dois ou três fótons (2P; 3P) a medição das taxas de fluxo sanguíneo tem se mostrado possível³⁶. No entanto, enquanto os vasos sanguíneos maiores são facilmente identificáveis por suas assinaturas de fluorescência endógena, a identificação de vasos sanguíneos pequenos sutis, variáveis e menos fluorescentes requer mais conhecimento. Essas dificuldades inerentes dificultam a segmentação de imagem ideal. Felizmente, essas fontes de fluorescência endógena (ou seja, glóbulos vermelhos e plasma de sangue) também podem ser medidas pela imagem de vida fluorescência³⁷, que capitaliza as propriedades fotofísicas únicas da vasculatura e representa uma adição útil à crescente caixa de ferramentas intravital.

Neste protocolo, um fluxo de trabalho para a segmentação de imagens intravitais quadridimensionais (4D) explicitamente utilizando sinais intrínsecos como fluorescência endógena e SHG é descrito desde a aquisição até a análise. Este protocolo é particularmente pertinente para estudos longitudinais através de uma janela de imagem mamária onde a fluorescência exógena pode não ser prática ou possível, como é o caso dos modelos PDX. Os princípios de segmentação aqui descritos, no entanto, são amplamente aplicáveis aos usuários intravitais que investigam biologia tumoral, desenvolvimento de tecidos ou mesmo fisiologia tecidual normal. O conjunto de abordagens de análise relatadas permitirá aos usuários diferenciar o comportamento celular entre regiões de configurações alinhadas ou aleatórias de fibra de colágeno, comparar números ou comportamentos de células residentes em regiões específicas do microambiente tumoral e mapear a vasculatura para o microambiente tumoral usando apenas sinal livre de rótulos ou intrínsecos. Juntos, esses métodos criam uma estrutura operacional para maximizar a profundidade das informações obtidas a partir da imagem intravital 4D da glândula mamária, minimizando a necessidade de rótulos exógenos adicionais.

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison. O bem-estar e o tratamento da dor em todos os experimentos com animais é primordial. Assim, todos os esforços são feitos para garantir que o animal esteja confortável e bem cuidado em cada etapa do procedimento.

1. Geração da janela de imagem mamária (MIW)

1. Para construir a janela de imagem mamária, forja um anel de 14 mm a partir de aço inoxidável de grau cirúrgico.
2. Limpe a estrutura da janela usinada usando uma solução quente de detergente de limpeza de 5%, enxágue por 10 minutos em água deionizada (DI), mergulhe em 100% etanol por 10 minutos e depois seque sob uma lâmpada de calor. Autoclave o quadro MIW seco e armazene-o para uso posterior.
3. Prepare o vidro de cobertura MIW da seguinte forma: Mergulhe o vidro redondo de cobertura de 1,5 12 mm em 100% etanol por 10 minutos, seque sob uma lâmpada de calor e, em seguida, fixe na estrutura de METAL MIW usando adesivo de cianoacrilato. Cure o adesivo da noite para o dia.
4. Limpe o MIW montado de adesivo em excesso usando um cotonete encharcado de acetona, e limpe-o submergindo-o em 70% de etanol por 10 minutos. Deixe a janela limpa secar. Prepare o MIW com antecedência e armazene-o em uma placa de Petri estéril antes da implantação cirúrgica.

2. Implantação cirúrgica do MIW

1. Ferramentas cirúrgicas autoclave e higienize superfícies com 70% de etanol antes de iniciar a cirurgia para a implantação da janela.
2. Faça uma cirurgia em uma mesa higienizada usando um cobertor aquecido coberto com um campo estéril. Coloque a manta de aquecimento de tal forma que a temperatura medida em cima do campo estéril seja de 40 °C.
3. Use iluminação fria auxiliar para ajudar a evitar a secagem de tecidos. Use lupas para facilitar o procedimento cirúrgico. Use EPI consistindo de um jaleco estéril, de uso único, mangas cirúrgicas, luvas, proteção ocular e máscara facial, conforme recomendado pelas melhores práticas cirúrgicas.
4. Anestesiar o mouse usando uma máquina vaporizadora de anestesia com uma configuração isoflurane de 2,0% e uma taxa de fluxo de oxigênio de 2,0 L/min. Administre analgésico (10 mg/kg de meloxicam) por injeção subcutânea.
   NOTA: Forneça doses adicionais nas primeiras 24h, preferencialmente a cada 8-12 h nos primeiros 2 dias após a cirurgia.
5. Uma vez anestesiado (confirmado sem resposta ao dedo do dedo do poço), aplique um gel ocular hidratante para evitar a secagem dos olhos. Use um creme depilatório para remover a pele no local da cirurgia (^4ª glândula mamária inguinal) seguida de enxaguamento com gaze estéril encharcada de água.
6. Prepare o local cirúrgico depilado para cirurgia, higienizando a superfície da pele com 3 esfoliantes alternados de betadina e etanol.
7. Para começar a cirurgia, levante suavemente a pele sobre a 4ª glândula mamária número 4 usando fórceps. Uma vez que a pele seja afastada da parede do corpo, remova uma seção de ~1 mm da camada dérmica na ponta dos fórceps com microlassa cirúrgica. Se ocorrer sangramento, aplique pressão suave com gaze estéril até que o sangramento pare.
   NOTA: Em geral, tumores maiores têm maior potencial para sangrar do que tumores menores ou tecidos normais.
8. Retire a glândula mamária da camada dérmica com movimentos suaves dos fórceps na abertura cirúrgica para evitar o corte da glândula subjacente.
9. Crie uma incisão de 10 mm e libere a glândula mamária da camada dérmica na periferia para que as suturas possam ser colocadas sem penetrar na glândula mamária. Adicione PBS para cobrir a glândula/tumor exposto e para evitar a secagem.
10. Crie uma sutura de corda de bolsa ao longo da periferia da abertura usando sutura trançada de seda 5-0. Insira uma borda do MIW para que a camada dérmica se envolva no entalhe receptor do MIW.
11. Estique suavemente o epitélio no lado oposto do MIW e empurre o MIW metálico para o lugar de tal forma que a camada dérmica engaje totalmente o entalhe receptor em torno de toda a circunferência MIW. Aperte a corda da bolsa firmemente para desenhar a camada dérmica no entalhe e amarre-a totalmente para fixar totalmente o MIW.
12. Adicione um antibiótico tópico à camada dérmica do MIW, e monitore continuamente o mouse até que ele tenha recuperado consciência suficiente para manter a recumbência severa. Abriga o mouse implantado pela MIW separadamente na cama macia com um iglu colocado na gaiola e permite que o mouse se recupere por 48 horas antes da imagem.

3. Posicionamento e manutenção do mouse no estágio do microscópio para imagem

1. Coloque a câmara de aquecimento no palco do microscópio. Use um sistema de ar forçado definido para 30 °C ou qualquer outro sistema semelhante. Use um aquecedor objetivo para evitar a deriva no foco z. Permita que o sistema se equilibre por pelo menos 1h antes da imagem.
   NOTA: Camundongos anestesiados são incapazes de manter adequadamente a temperatura corporal e, portanto, é necessário ter um ambiente aquecido para quaisquer aquisições de lapso de tempo. O aquecedor objetivo ajuda a combater os efeitos da expansão térmica, fenômeno que causa deriva no foco z à medida que a lente objetiva e o tecido que está sendo imageado chegam ao equilíbrio térmico.
2. Uma vez que a câmara de aquecimento do microscópio tenha estabilizado a 30 °C, anestesiar o mouse receptor com configurações da máquina de anestesia de 2% isoflurane e taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min.
3. Depois que o rato estiver sedado (confirmado por nenhuma resposta ao dedo do dedo do dedo do poço), limpe a parte externa do vidro MIW com um aplicador de algodão e limpador de vidro, adicione pomada para evitar a secagem e insira um cateter da veia da cauda, se necessário.
4. Para manter a hidratação adequada, dê uma injeção inicial de 0,5 mL PBS sub-cutâneo ou 100 μL através do cateter da veia traseira. Repita a cada 2h durante a sessão de imagem.
5. Uma vez que o mouse tenha sido devidamente preparado, configure o microscópio para imagem. Para reduzir a evaporação durante as medições de lapso de tempo, use um gel à base de água em vez de água para a mídia de imersão. Isso deve ser feito antes de colocar o mouse no palco. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes dos componentes ópticos.
6. Coloque o mouse no estágio do microscópio, encaixe a mangueira isoflurane e pressione a coleira do MIW em um orifício receptor de 14 mm na inserção do palco para estabilizar as imagens. Leve o campo de imagem em foco usando os oculares do microscópio e use iluminação de campo brilhante para observar a vasculatura com fluxo sanguíneo.
7. Verifique a estabilidade do campo de visão. Se os artefatos de movimento respiratório estiverem presentes, aplique uma compressão suave na parte traseira da glândula com um pequeno bloco de espuma e um pedaço de fita adesiva semelhante à cintura. Após a aplicação da compressão, verifique se o fluxo sanguíneo é mantido em todo o campo de visão.
8. Ajuste periodicamente os níveis de isoflurane em incrementos de 0,25% durante a sessão de imagem para manter um nível adequado de sedação, contando manualmente a respiração animal.
9. Mantenha uma taxa de 36-40 respirações por min (rpm) para melhorar a longevidade animal e a imagem óptica. Taxas de respiração mais baixas podem resultar na não sobrevivência do rato no experimento, enquanto as taxas de respiração acima de 60 rpm podem resultar em má sedação, o que pode aumentar a respiração e os artefatos de movimento nos dados da imagem.

4. Configuração para imagens intravitais 4D, baseadas em intensidade e sem rótulos do comportamento celular dinâmico

1. Uma vez que o mouse esteja sedado e posicionado com segurança no estágio do microscópio invertido, comece a localizar regiões de interesse.
2. Usando uma fonte de luz direcionada ao MIW, use os oculares do microscópio para identificar áreas potenciais para investigação. Adicione e salve as posições x e y no software para retornar a essas posições.
   NOTA: Os detalhes finos do tumor não serão facilmente visíveis com este tipo de iluminação. O objetivo é simplesmente identificar regiões para investigações mais aprofundadas. O foco é ver vasculatura e fluxo sanguíneo.
3. Depois de várias posições terem sido salvas no software, visualize os campos de exibição escolhidos usando excitação de 890 nm e o cubo de filtro FAD/SHG. Use um tempo máximo de moradia de 4 μs com menor potência e configuração pmt alta. O objetivo é visualizar os campos de visão sem expor excessivamente o tecido à luz laser excessiva.
4. Uma vez configurados níveis de energia apropriados, configure as pilhas z. Observe a aparência de fibras abundantes de colágeno (SHG) a 20-50 μm abaixo da superfície de vidro do MIW. O colágeno se tornará menos prevalente à medida que o microscópio se se for mais profundo no tumor (Figura 1B). Vazios no SHG revelam a localização das massas tumorais.
5. Coloque a fatia z superior, abaixo da camada de células solitárias onde as primeiras fibras de colágeno aparecem em ~50-100 μm. Coloque a fatia z inferior em ~250 μm, onde as fibras desaparecem e o sinal ruim domina. Repita isso para todas as posições x-y salvas.
6. Uma vez definida a faixa de pilha z, aumente o tempo de moradia (até 8 μs) e otimize as configurações de energia e detector. Otimize os níveis de energia conforme necessário para excitar o tecido para cada experimento. O uso de potências de até 90 mW a 750 nm ou 70 mW a 890 nm na abertura traseira do objetivo está dentro de um intervalo aceitável.
   NOTA: A profundidade de imagem, a quantidade de dispersão dentro do tecido, características objetivas e sensibilidade ao detector afetarão significativamente a quantidade de energia necessária para obter uma imagem.
7. Ajuste os intervalos de tempo de acordo com as metas experimentais. Comece com intervalos de 10 minutos entre os pontos de coleta para a maioria dos filmes de migração intravital.
8. Mesmo que a excitação 2P seja suave em células e tecidos, fique ciente de sinais de fototoxicidade, como sangramento de células ou aumento rápido da autofluorescência, e fotobleaching excessivo. Reduza a potência do laser ou aumente os intervalos de timelapse conforme as condições indicam.

5. Imagem vitalícia da fluorescência (FLIM) de NAD(P)H

1. Preservando as posições x-y das aquisições timelapse, configure o microscópio para coletar uma pilha FLIM. Insira um filtro 440/80 em um suporte de filtro na frente do detector GaAsP e defina a tensão do detector GaAsP para 800 no software. Desligue as luzes da sala quando os detectores estiverem ligados.
2. No software, mude da imagem de intensidade baseada em galvanômetro para um modo de imagem FLIM.
3. Com o objetivo de identificar e mascarar a vasculatura, defina a resolução para 512 x 512 pixels. Para coletar informações metabólicas complementares, defina a resolução para 256 x 256 pixels para aumentar a resolução temporal da assinatura vitalícia. Ajuste o tempo de moradia para 4 μs e ajuste o laser para 750 nm.
4. Inicie a varredura da visualização e comece a ajustar a potência do laser. Ajuste a potência do laser até que a leitura para a fração constante discriminatória (CFD) esteja entre 1 x 10⁵ e 1 x 10⁶. Não exceda 1 x¹⁰⁶ , pois isso resultará em acúmulo de fótons e resultados gerais ruins.
5. Uma vez definido o nível de potência, defina o tempo de integração entre 90 e 120 s e inicie a coleção FLIM. Ele adquirirá fótons do campo de visão pelo tempo alocado.
6. Opcional: Depois de todas as coletas necessárias terem sido feitas e o mouse tiver sido removido do palco, colete uma função de resposta ao instrumento (IRF). Meça o IRF por meio da imagem da superfície de cristais de ureia disponíveis comercialmente em um prato de fundo de vidro com os mesmos parâmetros e configurado usado para a imagem do tecido.
   NOTA: O IRF responde por quaisquer atrasos ou reflexos devido à configuração eletrônica ou óptica. O IRF está envolvido em todas as aquisições da FLIM, e desconvá-lo a partir dos dados pode melhorar a precisão das curvas calculadas de decadência de fluorescência. Dito isto, os IRFs calculados podem muitas vezes replicar razoavelmente a qualidade das curvas de decaimento da fluorescência a partir de IRF medido. É uma boa prática medir o IRF até que se determine que o IRF calculado produzirá ajustes equivalentes das curvas de decomposição e aproximadamente os resultados da IRF medida.

6. Análise de imagens nadh lifetime

1. Abra o software FLIM e importe a imagem vitalícia NAD(P)H do conjunto de dados. Para obter mais detalhes sobre como usar corretamente o software, consulte os manuais de vida fluorescentes (Veja tabela de materiais).
2. Para começar, defina os parâmetros do modelo no software. Na barra de menus, clique em Opções > Modelo. Selecione as seguintes caixas: Configurações > decadência multi-exponencial, método de ajuste > MLE, Binning Espacial > Square, Threshold > Peak e verifique a transferência de correção antes de calcular a imagem.
3. Na barra de menu, clique em Color >_{A 1}% do menu suspenso. No lado direito da janela, defina-o como um ajuste de três componentes. Ajuste o tamanho da caixa > 3.
4. Ajuste o limiar > ~10. Reavalie a precisão do limiar após a matriz de decomposição ter sido calculada pela primeira vez.
5. Conserte o τ1 a 200 ps. Isso representa a curta vida útil dos glóbulos vermelhos. Tente encontrar o valor que melhor corresponde a múltiplas manchas no vaso sanguíneo maior, o que pode ser visto na imagem de intensidade. Conserte o τ2 a 1200 ps. Isso representa a longa vida dos glóbulos vermelhos.
   NOTA: Os valores definidos são apenas o ponto de partida. Os valores precisarão ser otimizados para trazer mais vasculatura. Na maioria dos casos, mas nem sempre, esses valores diminuirão.
6. Em Calcular na barra de menu, selecione Decay Matrix. Isso vai gerar uma inicial de₁% de imagens ao longo da vida com a vasculatura tendo valores elevados. Use o cursor (mira) para pairar sobre a vasculatura. Sistematicamente e um de cada vez, flutuar (desmarque a caixa De fixação ) o τ1 e τ2. Registo esses valores, pois eles ajudarão a otimizar os parâmetros fixos.
   NOTA: O objetivo não é necessariamente obter os valores mais precisos na imagem, mas sim maximizar a disparidade entre a vasculatura e o tecido sem diminuir drasticamente a área identificada como vasculatura.
7. Uma vez identificados os parâmetros apropriados para τ1 e τ2, na barra de menu selecione Calcular > processamento em lote. Certifique-se de que a maioria das configurações são semelhantes entre as fatias z.
8. Certifique-se de verificar se não há uma configuração grosseiramente diferente das outras. Se assim for, ajuste o turno primeiro e tente novamente. Se o problema persistir, reajuste usando novos parâmetros. Uma mudança incorreta pode ser uma grande causa de ruído nas encaixes e pode aumentar os valores de₁% nas regiões tumorais adjacentes.
9. Na guia menu, salve os arquivos e_exporte arquivos A 1%. Carregue esses arquivos no ImageJ para mascarar e segmentar.

7. Segmentação de imagem da vasculatura

1. Abra ImageJ e importe a imagem A₁% como uma imagem de texto. Repita isso para todas as imagens dentro da pilha.
2. Com todas as imagens A₁% abertas, selecione Imagem > Stack > Z-Project. Use a Projeção de Intensidade Máxima e salve as imagens. Consulte dados suplementares 1 para uma imagem representativa.
3. Vá para Plugins > Segmentação. Selecione o plugin de segmentação WEKA³⁸.
4. Uma vez que a janela WEKA se abra, use as configurações padrão e comece a treinar o software criando duas classes e traçando linhas sobre a vasculatura (regiões de₁% altas) e não-vasculatura (regiões baixas A₁%).
5. Continue adicionando novos traços às duas classes até que o software identifique consistentemente as regiões altas de₁% da vasculatura, eliminando quaisquer regiões mais altas de ruído de fundo. Consulte modelo suplementar para modelo de classificador representativo.
6. Uma vez que a imagem classificada seja produzida, clique em Imagem > Tipo > 8 Bit. Limiar a imagem e criar uma máscara. Se a imagem limiar ainda precisa ser limpa ainda mais, use a função Analisar partículas .
7. Ajuste o tamanho e a circularidade até que quaisquer regiões menores e circulares da imagem limiar sejam excluídas. Uma máscara limpa com apenas a vasculatura e muito pouco fundo é obtida.
8. Clique em Editar > Seleção > Criar Seleção. Transfira a seleção para o gerente do ROI clicando em Analisar > Ferramentas > gerente de ROI.
9. Duplicar a imagem confidencial. Prossiga para processar > Binário. Para expandir a máscara e definir a distância da vasculatura que será incluída na segmentação de imagem, selecione Dilate. Repita até que a máscara se expanda para o alcance desejado. Registo essa região de interesse (ROI) no roi manager.
   NOTA: O objetivo desta etapa é quantificar a quantidade ou o comportamento dentro de uma certa proximidade do vaso sanguíneo (por exemplo, o número de células presentes dentro de X μm dos vasos sanguíneos). A quantidade de dilatação necessária é inteiramente determinada pela questão científica.
10. Para quantificar o número de células dentro das regiões restritivas, selecione a janela (imagem/canal) de interesse. Esta pode ser qualquer janela que compartilhe o mesmo campo de visão que a máscara vascular. Aplique ambos os ROI's usando a função XOR no menu suspenso.
    NOTA: Esta operação medirá os itens dentro da distância desejada da vasculatura, excluindo a vasculatura em si. Essa abordagem combinada do ROI pode então ser usada para medir uma infinidade de parâmetros, como intensidade, número de celular ou migração.

8. Segmentação de imagem do ninho tumoral

1. Abra a imagem NADH de uma varredura de alta resolução ou coleção FLIM no ImageJ.
   NOTA: Isso pode ser feito em fatias z individuais, pilhas completas ou aplicadas a projeções z de algumas fatias.
2. Vá para Plugins > Segmentação. Selecione o plugin de segmentação WEKA capacitável.
3. Uma vez que a janela WEKA se abra, use as configurações padrão e comece a treinar o software em duas classes de regiões altas naDH e regiões baixas do NADH. As regiões altas do NADH terão um padrão muito perceptível de células com núcleos e o software irá identificá-lo facilmente.
4. Continue alternando para frente e para trás com a sobreposição para refinar o algoritmo com treinamento adicional até que ele reconheça todas as regiões do tumor como determinado pelo conhecimento ocular e prévio da morfologia tumoral. Este é um processo iterativo.
5. Uma vez que o algoritmo reconheça todas as regiões do tumor, selecione o botão Criar resultado . Isso produzirá uma nova imagem. Duplicar essa imagem.
6. Selecione a primeira imagem duplicada e converta-a em uma imagem de 8 bits selecionando imagem > Tipo > 8 Bit. Limiar esta imagem para criar uma máscara binária. Em seguida, crie uma seleção e transfira-a para o gerente do ROI. Esses ROIs definirão o estroma.
7. Selecione a segunda da imagem duplicada e converta-a em uma imagem de 8 bits. Inverta esta imagem selecionando Imagem > Editar > Inverter e, em seguida, limiar essa imagem para criar uma máscara binária. Mais uma vez crie uma seleção e transfira para o gerente do ROI. Este ROI definirá o ninho tumoral.

9. Segmentação de imagem por organização ou alinhamento de fibras

1. Para começar, abra as imagens SHG, prepare qualquer projeção z e avalie a necessidade de qualquer pré-processamento. Para bons resultados, são necessárias imagens de alta qualidade com fibras discerníveis e baixo ruído.
2. Opcional: Para pré-processamento no ImageJ para aumentar o sinal-ruído (SNR) do canal SHG, subtraia o fundo usando uma subtração de bola rolando. Para a maioria das aplicações, use uma subtração de bola rolando entre 20 pixels e 50 pixels. Em seguida, suavizar a imagem e salvá-la.
3. Abra o plugin OrientationJ e defina os parâmetros de processamento. Na janela OrientationJ, defina o tamanho da janela tensor local. Para uma imagem de 20x desta densidade de fibras, coloque de 10 pixels a 15 pixels como ponto de partida.
4. Selecione o Spline cúbico como modelo de gradiente e verifique a Caixa de Pesquisa de Cores. Defina a pesquisa de cores. Defina tanto o Matiz quanto a Saturação como Coherência e, em seguida, defina o Brilho como Imagem Original, hit Run.
5. O arquivo de saída do plugin é o colormap RGB. Ajuste o valor da janela tensor local até que as regiões alinhadas, conforme determinado pelo olho, sejam devidamente destacadas com tons azuis e magentas.
6. Uma vez que a imagem de saída seja satisfatória, separe esta imagem RGB em 3 canais. Selecione Imagem > Color > Split Channel.
7. Para melhorar a aparência de regiões alinhadas com o propósito de mascarar, use a calculadora de imagem selecionando a Calculadora de Imagens processante >. Usando este operador, subtraia a imagem verde da imagem azul. Para uma máscara mais restritiva, subtraia a imagem verde da imagem vermelha. Para regiões aleatórias, subtraia o canal azul do canal verde.
8. Limiar a imagem resultante usando o algoritmo Moments . Na maioria dos casos, isso não deve precisar de mais ajustes. No entanto, ajuste se necessário. Isso produzirá uma imagem binária.
9. Uma vez feita a imagem binária, preencha os orifícios selecionando processe > Binário > preencher buracos entre fibras e arredondar os limites da máscara usando um filtro mediano. Um filtro mediano de 10 é um bom ponto de partida, ajuste-o para fazer um bom ajuste para os dados. Inspecione manualmente a máscara para obter concordância e remova quaisquer ROIs que estejam errados.
10. Uma vez que a máscara seja satisfatória, crie uma seleção selecionando Editar > Seleção > Criar Seleção. Transfira esta seleção para o gerente do ROI.

Resultados

A instalação do MIW e o planejamento experimental básico são os primeiros passos nesse processo. Este projeto e protocolo MIW em particular são mais favoráveis aos estudos longitudinais¹⁹ e tem sido utilizado com sucesso com microscópios eretos e invertidos. Neste caso, um microscópio invertido foi usado, pois resultou em maior estabilidade de imagem da glândula mamária com menos artefatos respiratórios. Na Figura 1A, fornecemos as dimensões do MIW rígido...

Discussão

A imagem intravital 4D é uma ferramenta poderosa para investigar interações fisiológicas dinâmicas dentro do contexto espacial e temporal do microambiente tumoral nativo. Este manuscrito fornece uma estrutura operacional muito básica e adaptável para compartimentar interações celulares dinâmicas dentro da massa tumoral, do estroma adjacente ou nas proximidades da rede vascular usando apenas sinais endógenos de segunda geração harmônica ou autofluorescência NAD(P)H). Este protocolo fornece um método abrang...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF