Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

Resumo

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Resumo

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um método baseado em fluorescência estabelecido usado para medir com sucesso distâncias dentro e entre biomoléculas in vitro , bem como dentro das células. No FRET, a eficiência da transferência de energia, medida por mudanças na intensidade ou na vida útil da fluorescência, relaciona-se à distância entre duas moléculas fluorescentes ou rótulos. A determinação da dinâmica e as mudanças conformais a partir das distâncias são apenas alguns exemplos de aplicações desse método aos sistemas biológicos. Sob certas condições, essa metodologia pode adicionar e aprimorar estruturas de cristal de raios-X existentes, fornecendo informações sobre dinâmica, flexibilidade e adaptação a superfícies de ligação. Descrevemos o uso de FRET e determinações de distância associadas para elucidar propriedades estruturais, através da identificação de um local de ligação ou das orientações de subunidades mais fracas. Através da escolha criteriosa de sites de rotulagem, e muitas vezes emprego de múltiplas estratégias de rotulagem, aplicamos com sucesso esses métodos de mapeamento para determinar propriedades estruturais globais em um complexo de DNA proteico e no sistema de translocação de proteínas SecA-SecYEG. No sistema SecA-SecYEG, usamos métodos de mapeamento FRET para identificar o local de ligação pré-proteína e determinar a conformação local da região de sequência de sinal vinculado. Este estudo descreve as etapas para a realização de estudos de mapeamento de FRET, incluindo identificação de locais de rotulagem adequados, discussão de possíveis rótulos, incluindo resíduos de aminoácidos não nativos, procedimentos de rotulagem, como realizar medições e interpretação dos dados.

Introdução

Para as proteínas, a elucidação da dinâmica juntamente com o conhecimento estrutural tridimensional (3-D) leva a uma compreensão aprimorada das relações estrutura-função dos sistemas biomoleculares. Métodos estruturais, como cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica criogênica, capturam uma estrutura estática e muitas vezes requerem a determinação de múltiplas estruturas para elucidar aspectos da ligação biomolécula e da dinâmica¹. Este artigo discute um método baseado em soluções para mapear elementos estruturais globais, como locais de vinculação ou interações vinculativas, que são potencialmente mais transitórios e menos facilmente capturados por métodos estáticos. Sistemas fortes candidatos a essa metodologia são aqueles em que uma estrutura 3D foi previamente determinada por cristalografia de raios-X, espectroscopia de NMR ou outros métodos estruturais. Neste caso, aproveitamos a estrutura de cristal de raios-X do complexo SecA-SecYEG, um player central na via secretary geral da proteína, para mapear a localização de um local de ligação de peptídeo de sinal usando a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) antes do transporte da pré-proteína através da membrana². A manipulação do sistema biológico através de modificações genéticas aliadas ao nosso conhecimento da estrutura 3D possibilitou a determinação da conformação da sequência de sinal e da região madura precoce imediatamente antes da inserção no canal ³.

O FRET envolve a transferência de energia sem radiação de uma molécula (doador) para outra (aceitadora) de forma dependente da distância que é através do espaço ^4,5. A eficiência dessa transferência é monitorada através de uma diminuição do doador ou um aumento na intensidade de fluorescência aceitadora. A eficiência da transferência de energia pode ser descrita como

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

em que o valor R₀ é a distância em que a transferência é 50% eficiente⁶. A técnica já foi descrita como uma régua molecular e é eficaz na determinação de distâncias na faixa de 2,5-12 nm, dependendo da identidade dos corantes aceitadores de doadores 4,7,8,9. As intensidades de fluorescência do doador e as vidas com ou sem aceitação permitem a determinação da eficiência de transferência e, consequentemente, distâncias ^5,8. Devido à disponibilidade da tecnologia, sensibilidade do método e facilidade de uso, a FRET também encontrou ampla aplicação em áreas como espectroscopia de fluorescência de molécula única e microscopia confocal⁶. O advento de proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde tornou a observação da dinâmica intracelular e da imagem de células vivas relativamente fácil^10,11. Muitas aplicações FRET como essas são discutidas detalhadamente nesta questão virtual.

Neste estudo, focamos particularmente no uso de medidas de FRET para produzir valores de distância para determinar detalhes estruturais. Anteriormente, as medidas de FRET têm sido efetivamente utilizadas para determinar a conformação de moléculas de DNA quando ligadas à proteína 12,13,14, a dinâmica interna das proteínas e interações de ligação proteica 15,16,17. As vantagens deste método residem na capacidade de determinar elementos estruturais flexíveis e dinâmicos em uma solução com quantidades relativamente baixas de material. Significativamente, este método é particularmente eficaz quando utilizado em conjunto com as informações estruturais existentes e não pode ser usado como um meio de determinação da estrutura 3D. O método fornece a melhor visão e refinamento da estrutura se o trabalho se baseia em informações estruturais existentes, muitas vezes acoplado à simulação computacional^18,19. Aqui, descreve-se o uso de distâncias obtidas a partir de medições fret de estado estável e tempo resolvidos para mapear um local de ligação, local do qual não se sabia, em uma estrutura cristalográfica existente do complexo SecA-SecYEG, grandes proteínas na via secreta³ geral.

O caminho secreto geral, um sistema altamente conservado de procariotes a eucariotes até arqueias, media o transporte de proteínas através ou para dentro da membrana para sua localização funcional na célula. Para bactérias gram-negativas, como e. coli, o organismo usado em nosso estudo, proteínas são inseridas ou translocadas através da membrana interna para o periplasma. O complexo de canal secy bacteriano (chamado translocon) coordena com outras proteínas para translocar a proteína recém-sintetizada, que é direcionada para sua localização correta na célula através de uma sequência de sinal tipicamente localizada no N-terminus^20,21. Para proteínas destinadas ao periplasma, a proteína ATPase SecA associa-se ao túnel de saída do ribossomo, e com a pré-proteína após aproximadamente 100 resíduos terem sido traduzidos²². Juntamente com a proteína acompanhante da SecB, mantém a pré-proteína em um estado desdobrado. A SecA se liga ao translocon SecYEG, e através de muitos ciclos de hidrólise ATP, facilita o transporte de proteínas através da membrana^23,24.

SecA é uma proteína multi-domínio que existe em formas citosolísticas e ligadas à membrana. Uma proteína homodimemérica no citosol, a SecA consiste em um domínio de ligação pré-proteína ou cross-linking²⁵, dois domínios de ligação de nucleotídeos, um domínio de asa helicoidal, um domínio helicoidal de andaimes e o dedo de duas hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). Em estudos cristalográficos anteriores do complexo SecA-SecYEG, a localização do THF sugeriu que ele estava ativamente envolvido na translocação de proteínas e subsequentes experimentos de ligação cruzada com o peptídeo de sinal estabeleceu ainda mais a importância desta região na translocação de proteínas^30,31. Estudos anteriores, utilizando a metodologia de mapeamento DA FRET, demonstraram que peptídeos de sinal exógenos se ligam a esta região da SecA ^2,32. Para compreender completamente a conformação e localização da sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína antes da inserção no canal SecYEG, foi criada uma quimera proteica na qual a sequência de sinal e resíduos da região madura precoce foram anexados à SecA através de um linker Ser-Gly (Figura 1). Usando essa construção biologicamente viável, foi demonstrado ainda que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína se ligam ao THF de forma paralela². Posteriormente, utilizou-se a metodologia de mapeamento DO FRET para elucidar a conformação e a localização da sequência de sinal e da região madura precoce na presença de SecYEG conforme descrito abaixo de³.

O conhecimento da estrutura 3D do complexo SecA-SecYEG ^33,34,35 e a possível localização do local de ligação nos permitiu colocar criteriosamente rótulos de doadores-aceitadores em locais onde a intersecção de distâncias individuais de FRET identifica a localização do local de vinculação. Estas medidas de mapeamento fret revelaram que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína formam um grampo de cabelo com a ponta localizada na boca do canal SecYEG, demonstrando que a estrutura do grampo de cabelo é modelada antes da inserção do canal.

Protocolo

1. Seleção de sites de rotulagem

1. Identifique pelo menos três potenciais locais de rotulagem para triangular o local de ligação putativa nas estruturas proteicas existentes. Neste caso, foram identificadas² SecA, SecYEG e pré-proteína anexada à SecA através de fusão genética.
   1. Escolha locais de rotulagem dentro de 25-75 Å do local de ligação putativa e em regiões relativamente estáticas da proteína, a distância determinará o par de corantes FRET específico a ser usado³⁶. Localize os locais de rotulagem em regiões proteicas relativamente distintas umas das outras, de modo que os locais descrevem os vértices de um triângulo com o local de ligação putativa localizado no centro (Figura 1A-D).
   2. Introduzir ou identificar resíduos de cisteína (Cys) em locais de rotulagem de interesse em uma proteína que não tenha outros resíduos de Cys, para melhorar a eficiência de rotulagem do local específico^37,38.
   3. Introduza aminoácidos não naturais, por exemplo, p-azidophenylalanine para rotulagem com química de clique, a fim de rotular efetivamente uma proteína em duas posições distintas com diferentes corantes^39,40.
   4. Teste os mutantes Cys para perda de função. Verifique a atividade do mutante sem cículas e do mutante aminoácido não natural usando um ensaio de atividade apropriado. Neste caso, a atividade foi verificada com um ensaio de crescimento seguido de um ensaio atpase verde in vitro ^{malachite 32,41,42}

2. Rotulagem da proteína

1. Purificar a proteína ou proteínas de interesse a pelo menos 95% de pureza para rotulagem precisa. Purificar proteínas SecA e SecYEG seguindo protocolos detalhados na referência³. Certifique-se de que você tenha pelo menos 5 μg de proteína purificada para esta etapa, pois alguma proteína será perdida durante o processo de rotulagem.
2. Escolha dois corantes para medições de FRET, dependendo do valor de R₀ e das distâncias previstas entre os locais rotulados. Estimar os valores R₀ e observar a emissão de doadores e a absorvência aceitante se sobrepõem utilizando as informações do banco de dados de proteínas fluorescentes, que também fornece espectros para corantes comumente usados (https://www.fpbase.org/spectra/)³⁶.
   NOTA: R₀ é definido como a distância em que a eficiência de transferência é de 50% para um determinado par de corantes. Para experimentos de mapeamento, as distâncias previstas devem ser próximas do valor R₀ do par de corantes para garantir que as distâncias possam ser medidas com precisão.
3. Rotular as posições identificadas na etapa 1.1.1. com o par de corante doador-aceitador.
   1. Rotule a proteína de acordo com as instruções do fabricante com especial atenção prestada a parâmetros como concentração de proteína ideal, temperatura, pH, tempo e tampão para os corantes específicos utilizados^43,44.
   2. Prepare a proteína a uma concentração de 1-2 mg/mL ou aproximadamente 10 μM em um buffer Tris-HCl de 25 mM (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE). Dissolver o corante em dimetilformamida (DMF) ou dimetilsulfoxida (DMSO) a uma concentração final de 1 mM. Adicione o corante dropwise à solução enquanto mexe para chegar a um corante: razão molar de proteína de 5:1 (50 μM de corante: 10 μM de proteína).
   3. Deixe a reação prosseguir por 4h à temperatura ambiente (RT) em um frasco de vidro com balanço suave ou durante a noite a 4 °C. Pare a reação adicionando β-mercaptoetanol.
      NOTA: Se a proteína não for compatível com tampão tris, podem ser usados tampões de fosfato ou HEPES. Mantenha o pH na faixa 7.0-7.5. Se a proteína tiver ligações de dissulfeto, adicione um agente redutor como DTT ou TCEP antes da rotulagem. Remova o DTT por diálise ou filtragem de gel antes de adicionar corante.
4. Para medições precisas de FRET, remova o corante livre com um concentrador centrífugo com um corte de peso molecular apropriado (MWCO) para deixar o corante livre fluir enquanto retém a proteína rotulada.
   1. Prepare a membrana concentradora colocando ~ 1 mL de água na parte superior de um concentrador de 3 mL e, em seguida, centrífugue a água através da membrana (pelo menos 10 min a 4.300 x g).
   2. Remova o corante livre por centrifugação da amostra rotulada no concentrador (20 min a 4.300 x g). Repita 3-4 vezes e descarte o fluxo através.
   3. Verifique a eficiência de rotulagem da proteína rotulada usando espectroscopia de absorção UV-Vis.
      NOTA: As medidas de FRET requerem eficiência de rotulagem de 50% ou mais. Menores eficiências de rotulagem reduzem o sinal FRET e podem levar a imprecisões na medição.
   4. Obtenha um espectro UV-Vis da proteína rotulada com uma faixa de 250-700 nm para observar tanto a banda de absorção de proteínas quanto a faixa de absorção máxima de corante. Meça a absorção no pico de absorção de corante e em 280 nm para proteína.
   5. Determine a concentração de proteína e corrija para quaisquer contribuições do corante utilizando o fator de correção, CF, e as seguintes equações^45,46:
      
      onde C é a concentração da proteína (M), A₂₈₀ é a absorvância amostral a 280 nm, A_máxima é a absorção no máximo de absorção de corante, ε proteína é o coeficiente de extinção para a proteína a 280 nm e CF é o fator de correção, _A'280/_A'max, onde _A'280 é a absorvância a 280 nm e _A'max é a absorção no máximo máximo para o corante.
   6. Determine a eficiência de rotulagem usando a seguinte equação:
      
      onde ε_corante é o coeficiente de extinção molar do corante, C é a concentração da proteína conforme determinado na etapa 2.4.5, e E é a eficiência de rotulagem. Repetir o passo 2.4.2 até que o valor de eficiência de rotulagem tenha subido e seja inferior a 100%.

3. Determine os valores R ₀

1. Meça os valores R₀ in situ. Prepare duas amostras de proteínas na mesma concentração de proteína total, 4 μM, uma com a proteína rotulada apenas com o corante doador e outra com a proteína rotulada apenas com o corante aceitador. Para a SecA, uma concentração proteica de 4 μM Monômero SecA funciona bem para essas medidas.
   1. Prepare volumes amostrais de 2,5 mL para um cuvette de 1 cm x 1 cm, 600 μL para um cuvette de 5 mm x 5 mm ou 200 μL para um cuvette de 3 mm x 3 mm.
2. Ligue o fluorômetro e abra o programa de aquisição e análise espectral no software de fluorescência se usar um espectrofluorômetro. Clique no M vermelho para conectar o computador ao instrumento (Figura 2A) e escolha O Espectro de Emissões.
   1. Digite parâmetros de varredura, como comprimento de onda de excitação, a faixa para varredura de emissões, temperatura e posição de trocador de amostras usando o item do menu Coletar experimento (Figura 2B).
   2. Clique no RTC e otimize as configurações do instrumento (por exemplo, fendas espectrais) monitorando a emissão de fluorescência no pico usando um comprimento de onda de excitação no máximo de absorção do corante. Para SecA, defina as seguintes configurações: bandpass como 1 nm; excitação e emissão de fendas como 1 e 1,5 mm, respectivamente, com a temperatura a 25 °C e velocidade de agitação a 250 rpm.
      NOTA: Não exceda a capacidade de contagem por segundo (cps) do instrumento (tipicamente 2 x 10⁶ cps).
3. Coloque a amostra de proteína rotulada do doador no titular da amostra e clique Em executar para gerar uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com o corante doador (proteína apenas do doador) ao excitar a amostra no máximo de absorção de corante (por exemplo, 488 nm para AF488) e escanear sobre o pico de emissão (505-750 nm para doador apenas proteína SecA rotulada com AF488).
4. Estabeleça uma linha de base para a varredura estendendo a varredura de 25-50 nm após o final do pico. Meça o rendimento quântico da proteína somente para doadores, realizando medições de absorção e fluorescência em amostras de diferentes concentrações como descrito⁴⁷. Mantenha as mesmas configurações de fenda para essas medidas.
   1. Use corante doador gratuito como referência para o rendimento quântico. Obtenha pelo menos quatro medidas da proteína somente para doadores e o corante livre em diferentes concentrações para uma determinação precisa.
   2. Plote a intensidade da fluorescência ou área integrada versus a absorvância para a proteína somente do doador e o corante ou referência gratuito. Determine as encostas para a proteína somente para doadores (Inclinação_D) e a referência (Inclinação_R).
   3. O rendimento quântico (Φ) é calculado usando a seguinte equação:
      
      aqui Φ_D é o rendimento quântico da proteína apenas do doador, Φ_R é o rendimento quântico do corante livre (isso geralmente pode ser obtido do fabricante), Inclinação_D e Inclinação_R são as inclinações determinadas na etapa 3.4.2 para o doador apenas proteína e referência, respectivamente e η_D e η_R representam o índice de refração da proteína somente para doadores e as soluções de corante sem referência, respectivamente ⁴⁷.
5. Obtenha um espectro de absorção de sua proteína somente aceitadora usando uma célula de comprimento de 1 cm. Gere um espectro de coeficiente de extinção de sua proteína somente para aceitador dividindo o espectro de absorção pela concentração de corante.
6. Gerar a sobreposição espectral integral, J (λ) usando um programa de análise gráfica. Um programa de planilha padrão (por exemplo, planilha) também pode ser usado para este processo.
   1. Multiplique o espectro de emissão de fluorescência da proteína somente para doadores (passo 3.4) pelo espectro de coeficiente de extinção da proteína somente aceitadora para gerar o espectro de sobreposição.
   2. Multiplique o espectro de sobreposição resultante por λ⁴.
   3. Determine a área sob a curva por integração da região de sobreposição. A região de sobreposição é definida como a área onde o espectro de emissão de doadores multiplicado pelo espectro de coeficiente de extinção aceitar produz valores positivos. A sobreposição espectral integral é definida como:
      
      onde F_D (λ) é o espectro de emissão da proteína somente para doadores (obtida na etapa 3.4) e ε_A(λ) é o espectro de coeficiente de extinção da proteína somente aceitadora e possui unidades de ^{M-1 cm-1} (obtidas na etapa 3.5). A sobreposição espectral resultante integral deve ter unidades de ^{M-1 cm-1}nm⁴.
   4. Normalize a sobreposição espectral integral. Divida a integração sobreposta pela área integrada do espectro proteico apenas do doador sobre a mesma faixa espectral:
      
   5. Calcule o valor R₀ em Å usando a seguinte equação:
      
      onde ^{κ 2} é o fator de orientação, tipicamente tomado como 2/3 para corantes livremente rotativos, η é o índice de refração e pode ser aproximado como 1,33 para soluções aquosas diluídas, Q_D é o rendimento quântico do doador (etapa 3.4) e J(λ) é a sobreposição espectral integral como determinado na etapa 3.6.35. NOTA: Se os corantes não estiverem girando livremente, as correções podem ser introduzidas conforme descrito por Ivanov ⁴⁸ e implementados por Auclair⁴⁹ e Zhang ^2,3.

4. Realizar medições espectrais de FRET

1. Preparar amostras de proteína somente para doadores, proteínas somente aceitadoras e proteínas aceitadoras de doadores na mesma concentração; recomenda-se uma concentração de 4 μM. Use 200 μL de solução, se usar um cuvette de 3 mm x 3 mm, 600 μL se usar um cuvette de 5 mm x 5 mm, ou 2,5 mL se usar um cuvette de 1 cm x 1 cm.
   1. Prepare a amostra proteica doador-aceitante usando quantidades molares iguais apenas do doador e aceitando apenas proteína.
   2. Manter a mesma quantidade de amostra rotulada apenas no doador de controle e aceitar apenas amostras de proteína através da introdução de proteína sem rótulo em quantidade molar igual ao doador ou apenas amostras aceitadoras. Por exemplo, para soluções da mesma concentração, cada amostra fret somente para doadores conteria 100 μL de proteína somente para doadores e 100 μL de proteína sem rótulo para um volume de 200 μL.
2. Gerar espectros de emissão de fluorescência apenas do doador, apenas aceitador, e amostras de aceitadores de doadores. Otimize o sinal conforme descrito na etapa 3.2. Uma vez otimizado manter as mesmas configurações para todas as amostras.
   1. Obtenha a varredura somente para doadores, conforme descrito na etapa 3.3. Excite a solução no máximo de absorção de corantes doadores e escaneie sobre os picos de emissão do doador e (esperado).
   2. Ou troca a amostra pela proteína somente para o aceitador ou altera a posição do trocador de amostras para a cuvette que contém a proteína somente aceitadora.
   3. Obtenha uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com corante aceitador (apenas proteína aceitante) utilizando as mesmas configurações da etapa 4.2.1. Excite a amostra no comprimento de onda de excitação do doador.
      NOTA: Este espectro fornece uma correção para a quantidade de aceitador animado no comprimento de onda do doador (F_A na etapa 5.1.2)
   4. Troque a amostra para a amostra de proteína aceitadora do doador ou altere a posição do trocador de amostras para a cuvette contendo a proteína rotulada do doador.
   5. Obtenha uma varredura de emissão da amostra de proteína aceitadora do doador utilizando as mesmas configurações das etapas 4.2.1 e 4.2.3.
   6. Para todos os espectros, corrija para fluorescência de fundo subtraindo as contagens de fundo medidas no final da varredura.
3. Meça a vida útil do doador apenas do doador e amostras de doador-aceitador preparadas conforme descrito na etapa 4.1.2. Use um instrumento de fluorescência de contagem de fótons de contagem de fótons correlacionados com tempo capaz de medir e resolver decaimentos fluorescentes na faixa de tempo nanossegundo (^10-9 s).
   NOTA: Para os pares de corantes FRET, combine a fonte de luz de excitação com o máximo de absorção do corante doador.
   1. Ligue o instrumento. Abra o software de aquisição, use o software de controle de instrumentos para aquisição de dados com o espectrômetro de fluorescência.
   2. Para aquisição, selecione TCSPC Decay, com um intervalo de tempo de 55 ns, um ganho de 1 e 4096 canais.
   3. Obtenha uma função de resposta de instrumento (IRF) utilizando uma solução de creme não lácteo ou solução de dispersão comercial e monitore a dispersão a 490 nm. Ajuste a configuração da fenda e use filtros de densidade neutra conforme necessário para manter uma taxa de contagem baixa o suficiente para evitar o acúmulo de pulso⁵. Clique em Aceitar e, em seguida, Iniciar. Isso vai começar a aquisição.
      NOTA: Uma taxa máxima de contagem de 4000 cps é usada para uma taxa de repetição de 180 kHz.
   4. Colete o IRF a 490 nm até que o canal de pico tenha um máximo de 20.000 contagens. Colete um IRF antes e depois de medir cada decadência de fluorescência.
   5. Obtenha as decaimentos de fluorescência apenas do doador e amostras de doador-aceitador monitorando a emissão de fluorescência no comprimento de onda de emissão do doador, 520 nm.
   6. Ajuste as configurações da fenda para uma taxa máxima de contagem de 4000 cps ou menos. As configurações de fenda são tipicamente de 15-20 nm de bandpass para amostras de proteínas. Recolher a decadência até que 20.000 contagens sejam obtidas no canal de pico.
4. Analise a decadência ou a intensidade da fluorescência (I) em função do tempo (t) para a vida fluorescência (τ). Encaixe a decadência a uma soma de exponenciais com a seguinte equação:
   
   onde α_eu sou o fator pré-positivo do i ^th componente_{e eu sou} a vida toda. O ajuste é reconvolved com o IRF para combinar com a decadência fluorescência. Julgue a qualidade do ajuste a partir dos parâmetros χ² reduzidos.

5. Análise dos dados do FRET

1. Calcular a eficiência do FRET a partir da diminuição da intensidade do doador da amostra doador-aceitadora em relação ao doador apenas com a equação a seguir.
   
   onde f_da é a intensidade de fluorescência da amostra doador-aceitador e F_D é a intensidade de fluorescência do doador apenas amostra no auge da fluorescência do doador. Use as áreas integradas dos picos se os dados forem barulhentos.
   1. Corrija para quaisquer diferenças na rotulagem apenas entre as amostras doadoras e aceitadoras de doadores. Calcular correções com base no grau de rotulagem do doador da seguinte forma.
      
      onde f_DA é a eficiência de rotulagem de doadores na amostra de aceitador de doadores e f_D é a eficiência de rotulagem na amostra somente de doadores.
   2. Correto para quaisquer contribuições da fluorescência aceitadora para o espectro animado pelo doador através da subtração do espectro proteico somente aceitador (passo 4.2) do espectro proteico aceitador de doadores.
      
   3. Correto para as diferenças na eficiência de rotulagem do aceitador apenas proteína em relação à amostra de proteína aceitadora de doadores, produzindo a seguinte equação para calcular a eficiência:
      
      onde f_A denota a quantidade fracionada de rotulagem aceitadora. Esta equação inclui todas as correções devido à rotulagem de tingimento e fluorescência aceitadora.
   4. Calcular distâncias DE FRET das eficiências usando a seguinte equação:
      
      utilizando o valor R₀ obtido na etapa 3.6.5.
   5. Calcule a eficiência do FRET usando a vida útil da fluorescência apenas do doador e amostras aceitadoras de doadores medidas na etapa 4.3.3-4.3.5:
      
   6. Use a vida útil ponderada por amplitude para calcular a eficiência do FRET e comparar com os resultados de estado estável⁵.
      
   7. Calcule a distância como na etapa 5.1.4 a partir da eficiência determinada pela vida útil da fluorescência. Compare valores de estado estável e tempo resolvidos para eficiências e distâncias de FRET e certifique-se de que eles estão dentro do erro um do outro.

6. Mapeando as distâncias

1. Use as distâncias calculadas para mapear o local de ligação na estrutura tridimensional. Calcule as distâncias e erros de todos os pares de corantes e locais examinados utilizando a equação dada nos valores passo 5.1.4 e R₀ obtidos na etapa 3.6.5 para cada par DE FRET.
   1. Use um programa de visualização gráfica 3D, como o PyMOL⁵⁰ , para mapear as distâncias na estrutura (script dado em Arquivo Suplementar). Os comandos do script podem ser inseridos diretamente na janela de comando com as informações de distância apropriadas.
   2. Gerar um shell para cada distância medida e o erro associado (Figura 3, Figura 4, Figuras Suplementares 1-3).
   3. Mapeie a posição através da intersecção das diferentes conchas (Figuras Suplementares 1-3). O local de ligação do peptídeo de sinal foi mapeado através dos três locais diferentes na SecA e SecYEG e quatro locais diferentes no peptídeo de sinal (Figura 1).

Resultados

Este estudo concentrou-se em determinar a localização do local de ligação pré-proteína na SecA antes da inserção da pré-proteína no canal SecYEG. Para mapear o local de ligação, foram realizados experimentos de FRET entre diferentes regiões da pré-proteína e três locais distintos nas proteínas SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Das distâncias obtidas e estruturas tridimensionais da SecA, SecYEG e pré-proteína, a localização do local de ligaç...

Discussão

Através do uso da metodologia de mapeamento FRET, identificamos o local de ligação da sequência de sinal na proteína SecA. É importante ressaltar que a presença de uma estrutura de cristal 3D do complexo facilitou muito nosso estudo. A força dessa metodologia de mapeamento está na capacidade de usar uma estrutura existente para identificar locais para rotulagem. Esta metodologia não pode ser usada para determinar uma estrutura 3D; no entanto, a determinação dos elementos estruturais⁵⁶,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
490 nm LED laser	Horiba	1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne	Life Technologies	A20347
Agar	Difco	DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne	Life Technologies	A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)	Sigma	UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)	Anatrace	D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
extended signal peptide SP41	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
FluorEssence	Horiba	version 2.4	spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer	Horiba	N/A
GlobalsWE	Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine		spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH	BACHEM	4020250.0001
LB (Miller) Broth	Fisher Scientific	BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)	Sigma-Aldrich	420816	dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX	Horiba	version 4.1.0.4096	spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument	Horiba	NA
Pymol Molecular Graphics Program	Schrodinger	version 2.4
Water bath	Thermo Scientific	NESLAB RTE 10