Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Resumo

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Resumo

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) surgiu como uma poderosa técnica de imagem óptica para diagnóstico de tecidos. Nos últimos anos, o SRS de duas cores mostrou-se capaz de fornecer imagens equivalentes à hematoxilina e eosina (H&E) que permitem um diagnóstico rápido e confiável do câncer cerebral. Tal capacidade permitiu aplicações emocionantes de diagnóstico de câncer intraoperatório. A imagem de tecido srs de duas cores pode ser feita com uma fonte de laser picosegundo ou femtosegundo. Os lasers Femtosegundos têm a vantagem de permitir modos de imagem flexíveis, incluindo imagens hiperespectrais rápidas e imagens srs em tempo real de duas cores. Uma abordagem espectral com pulsos laser chirped é tipicamente usado com lasers femtosegundos para alcançar alta resolução espectral.

A aquisição de SRS de duas cores pode ser realizada com modulação ortogonal e detecção de lock-in. A complexidade do pulso, modulação e caracterização é um gargalo para a adoção generalizada desse método. Este artigo fornece um protocolo detalhado para demonstrar a implementação e otimização do SRS focado no espectral e imagens em tempo real de duas cores do tecido cerebral do camundongo no modo epi. Este protocolo pode ser usado para uma ampla gama de aplicações de imagem SRS que aproveitam a alta velocidade e capacidade de imagem espectroscópica do SRS.

Introdução

Os diagnósticos tradicionais de tecido dependem de protocolos de coloração seguidos de exame sob um microscópio óptico. Um método comum de coloração usado pelos patologistas é a coloração de H&E: manchas de hematoxilina nos núcleos celulares um azul arroxeado, e eosina mancha a matriz extracelular e citoplasma rosa. Essa simples coloração continua sendo o padrão ouro na patologia para muitas tarefas de diagnóstico de tecido, particularmente o diagnóstico de câncer. No entanto, a histopatologia H&E, particularmente a técnica de secção congelada usada em um ambiente intraoperatório, ainda tem limitações. O procedimento de coloração é um processo trabalhoso que envolve i....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais de animais foram realizados com cérebros de camundongos fixos e seccionados de 200 μm, de acordo com o protocolo (nº 4395-01) aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Washington. Os camundongos do tipo selvagem (cepa C57BL/6J) são eutanizados com CO₂. Em seguida, uma craniotomia é realizada para extrair seus cérebros para fixação em 4% de paraformaldeído em soro fisco tamponado. Os cérebros são embutidos em uma mistura de 3% de agarose e 0,3% de gelatina e seccionados em fatias de 200 μm de espessura por um vibratome.

1. Alinhamento inicial

Resultados

Otimização da resolução espectral:
A dispersão através de um material é afetada pelo meio dispersivo (comprimento e material) e comprimento de onda. A alteração do comprimento da haste de dispersão afeta a resolução espectral e o tamanho do sinal. É uma relação de dar e receber que pode ser ponderada de forma diferente dependendo da aplicação. As hastes esticam o pulso do feixe de ser larga em frequência e estreita no tempo para ser estreita em frequência e larga no tempo.

Discussão

O esquema de imagem SRS de duas cores apresentado neste protocolo depende da implementação adequada de imagens SRS de uma cor. Em imagens de SRS de uma cor, as etapas críticas são alinhamento espacial, alinhamento temporal, profundidade de modulação e mudança de fase. A combinação espacial dos dois feixes é realizada por um espelhodicróico. Vários espelhos de direção são usados para ajuste fino ao enviar as vigas para o espelho dicroico. Uma vez que os feixes são combinados com o espelho dicroico, o alinh.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.