Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Resumo

Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.

Resumo

A microscopia eletrônica de transmissão tem sido considerada por muito tempo o padrão-ouro para a visualização da ultraestrutura celular. No entanto, a análise é muitas vezes limitada a duas dimensões, dificultando a capacidade de descrever totalmente a ultraestrutura tridimensional (3D) e a relação funcional entre organelas. A microscopia eletrônica de volume (vEM) descreve uma coleção de técnicas que permitem o interrogatório da ultraestrutura celular em 3D em resoluções de mesoescala, microescala e nanoescala.

Este protocolo fornece um método acessível e robusto para adquirir dados vEM usando a transmissão de seção serial EM (TEM) e abrange os aspectos técnicos do processamento de amostras até a reconstrução 3D digital em um único e simples fluxo de trabalho. Para demonstrar a utilidade dessa técnica, apresenta-se a relação ultraestrutural 3D entre o regúrio endoplasmático e mitocôndrias e seus locais de contato em hepatócitos hepáticos. Os contatos interorganelle servem papéis vitais na transferência de íons, lipídios, nutrientes e outras pequenas moléculas entre organelas. No entanto, apesar de sua descoberta inicial em hepatócitos, ainda há muito a aprender sobre suas características físicas, dinâmicas e funções.

Os contatos de Interorganelle podem exibir uma gama de morfologias, variando na proximidade das duas organelas umas com as outras (tipicamente ~10-30 nm) e a extensão do local de contato (de contatos pontuados a contatos cisternas maiores). O exame de contatos próximos requer imagens de alta resolução, e a seção serial TEM é adequada para visualizar a ultraestruturação 3D de contatos interorganelle durante a diferenciação de hepatócitos, bem como alterações na arquitetura hepatócito associada a doenças metabólicas.

Introdução

Desde sua invenção na década de 1930, microscópios eletrônicos permitiram aos pesquisadores visualizar os componentes estruturais das células e tecidos ^1,2. A maioria das investigações forneceu informações 2D, pois a construção de modelos 3D requer uma minuciosa coleção de seções seriais, fotografia manual, processamento negativo, rastreamento manual e a criação e montagem de modelos 3D a partir de folhas de vidro, plástico ou isopor ^3,4. Quase 70 anos depois, houve avanços consideráveis em inúmeros aspectos do processo, desde o desempenho do microscópio, coleta de seções seriais, imagem digital automatizada, software e hardware sofisticados para reconstrução 3D, visualização e análise até abordagens alternativas para o que agora é chamado coletivamente de volume EM (vEM). Essas técnicas de vEM são geralmente consideradas para fornecer informações ultraestruturais 3D em resoluções de nanômetros através de escalas de micron e englobar as técnicas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e novas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (SEM); ver avaliações 5,6,7,8.

Por exemplo, o feixe de íons focados SEM (FIB-SEM) usa um feixe de íons focado dentro de um SEM para frear a superfície do bloco entre imagens sem sequenciais da superfície do bloco, permitindo a repetida fresagem/imagem automatizada de uma amostra e construindo um conjunto de dados 3D para reconstrução ^9,10. Em contrapartida, a face de bloco serial SEM (SBF-SEM) usa um ultramicrotome dentro do SEM para remover material da face do bloco antes da imagem^11,12, enquanto a tomografia de matriz é um processo não destrutivo que requer a coleta de seções seriais, em clipes de cobertura, wafers ou fita, antes de configurar um fluxo de trabalho automatizado de imagem da região de interesse em seções sequenciais no MEI para gerar os dados^{3Dset 13} . Semelhante à tomografia de matriz, a seção serial TEM (ssTEM) requer que seções físicas sejam coletadas antes da imagem; no entanto, essas seções são coletadas em grades TEM e imagens em um TEM 14,15,16. ssTEM pode ser estendido realizando tomografia inclinada 17,18,19. A tomografia de inclinação serial fornece a melhor resolução em x, y e z, e embora tenha sido usada para reconstruir células inteiras²⁰, é razoavelmente desafiadora. Este protocolo se concentra nos aspectos práticos do SSTEM como a técnica vEM mais acessível disponível para muitos laboratórios EM que podem não ter acesso a seção especializada ou instrumentos vEM, mas se beneficiariam da geração de dados vEM 3D.

A ultramicrotomia serial para reconstrução 3D já foi considerada desafiadora. Era difícil cortar fitas retas de espessura de seção uniforme, ser capaz de organizar e pegar fitas do tamanho correto, na ordem correta, em grades com suporte suficiente, mas sem grades de grade obscurecendo regiões de interesse, e o mais importante, sem perder seções, pois uma série incompleta pode impedir a reconstrução 3D completa²¹. No entanto, melhorias nos ultrassoms comerciais, corte de diamantes e facas^{de corte 22,23}, filmes de suporte lucente de elétrons nas grades^21,24, e adesivos para auxiliar a adesão de seção e preservação da fita^13,21 são apenas alguns dos avanços incrementais ao longo dos anos que tornaram a técnica mais rotineira em muitos laboratórios. Uma vez coletadas seções seriais, a imagem serial no TEM é simples e pode fornecer imagens EM com tamanhos px subnanômetros em x e y, permitindo interrogatórios de alta resolução das estruturas subcelulares - um requisito potencial para muitas questões de pesquisa. O estudo de caso aqui apresentado demonstra o uso de ssTEM e reconstrução 3D no estudo de contatos endoplasmicas de rcístulo (ER)-organela em hepatócitos hepáticos, onde os contatos ER-organela foram observados pela primeira vez^25,26.

Apesar de ser contíguo com o envelope nuclear, o ER também faz contatos próximos com inúmeras outras organelas celulares, incluindo lysosomes, mitocôndrias, gotículas lipídicas e a membrana plasmática²⁷. Os contatos er-organela foram implicados no metabolismo lipídico²⁸, fosfoinostito e sinalização de cálcio²⁹, regulação da autofagia e resposta ao estresse^30,31. Os contatos er-organela e outros contatos interorganelle são estruturas altamente dinâmicas que respondem às necessidades metabólicas celulares e pistas extracelulares. Eles têm sido mostrados variando morfologicamente em seu tamanho e forma e as distâncias entre as membranas organela^32,33. Acredita-se que essas diferenças ultraestruturais provavelmente refletem suas diferentes composições proteicas/lipídicas e funcionam^34,35. No entanto, ainda é uma tarefa desafiadora definir contatos interorganelle e analisá-los³⁶. Por isso, é necessário um protocolo confiável, porém simples, para examinar e caracterizar contatos interorganelle para investigações posteriores.

Como os contatos er-organela podem variar de 10 a 30 nm na separação membrana-membrana, o padrão-ouro para identificação tem sido historicamente TEM. O TEM de seção fina revelou localização específica de subdomínios para proteínas de ER residentes em contatos de membrana^{distinta 37}. Tradicionalmente, isso tem revelado contatos er-organela com resolução nm, mas muitas vezes apenas apresentou uma visão 2D dessas interações. No entanto, as abordagens vEM revelam a apresentação ultraestrutural e o contexto desses sites de contato em 3D, permitindo a reconstrução completa dos contatos e classificação mais precisa de contatos (ponto vs. tubular vs. cisterna-like) e quantificação^38,39. Além de ser o primeiro tipo de célula onde foram observados contatos ER-organela^25,26, os hepatócitos possuem um extenso sistema de outros contatos interorganelles que servem a papéis vitais em sua arquitetura e fisiologia^28,40. No entanto, ainda falta uma caracterização morfológica completa da ER-organela e de outros contatos interorganelles em hepatócitos. Assim, como os contatos interorganelle formam e remodelam durante a regeneração e reparação é de particular relevância para a biologia hepatocita e função hepática.

Protocolo

Todos os animais foram alojados de acordo com as diretrizes do Ministério do Interior do Reino Unido, e a colheita de tecidos foi realizada de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986.

1. Fixação e preparação de espécimes

1. Disseque o tecido hepático em pedaços de tamanho apropriado, aproximadamente 8 mm x 8 mm x 3 mm, e coloque as peças em soro fisco tamponado quente (PBS, 37 °C).
2. Injete temperatura ambiente (20-25 °C) fixação (1,5% glutaraldeído em 1% de sacarose, 0,1 M de cacodilato de sódio) nos pedaços do fígado e transfira-os de PBS para fixação por até 20 minutos à temperatura ambiente. Mantenha sempre o tecido submerso em soluções para evitar a secagem.
   NOTA: Aldeídos são irritantes corrosivos e potencialmente cancerígenos. Cacodilato de sódio é tóxico se engolido ou inalado. Todos os fixativos devem ser manuseados usando equipamentos de proteção individual adequados, e o experimento deve ser realizado em um capô de fumaça. Uma boa fixação resultará em um tecido mais firme.
3. Configure o microtome vibratório com uma lâmina, banho de gelo e uma bandeja de tampão fria cheia de PBS. Monte o primeiro pedaço de tecido hepático fixo em um suporte de espécime com cola cianoacrilato e transfira o bloco para o microtoma vibratório.
4. Seguindo as recomendações do fabricante, aproxime-se do tecido e corte o fígado fixo em fatias de 100 μm de espessura.
5. Colete as fatias usando uma espátula ou escova de tinta natural e transfira-as para um prato de 12 ou 24 poços contendo correção gelada (1,5% glutaraldeído, 0,1 M de cacodilato de sódio) no gelo. Deixe as fatias no gelo até que todas as amostras tenham sido cortadas e estejam prontas para serem processadas ainda mais.
6. Selecione as fatias que contenham as regiões de interesse para posterior processamento e lave com agitação suave. Realize três, 5 min de lavagem com temperatura ambiente 0,1 M de cacodilato de sódio em um prato de 12 ou 24 poços, garantindo que as fatias tenham tampão suficiente para se mover livremente.
   NOTA: Em geral, as regiões de interesse são selecionadas com base em características anatômicas relacionadas à questão biológica do estudo e orientadas por regiões do tecido que provavelmente estarão presentes em toda a série, por exemplo, não na borda da seção, e que estão bem preservadas.
7. Em um capô de fumaça, substitua 0,1 M de cacodilato de sódio por 1% de tetroxida de ósmio/1,5% ferricyanida de potássio. Coloque o prato de 12 ou 24 poços em um recipiente selado e transfira o recipiente para uma geladeira de produtos químicos perigosos por 1h.
   NOTA: O ósmio é extremamente perigoso em caso de ingestão, inalação e contato com a pele. Ferricyanida de potássio é irritante e é prejudicial por inalação e contato com a pele. Sempre manuseie usando equipamentos de proteção individual adequados e realize o experimento em um capô de fumaça.
8. Em um capô de fumaça, remova o tetroxida de ósmio/ferricyanida de potássio em uma garrafa dedicada de resíduos de ósmio e lave as amostras por 5 minutos com 0,1 M de cacodilato de sódio três vezes. Deixe as amostras em um recipiente selado durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Ponto de pausa potencial. As amostras podem ser armazenadas em cacodilato de sódio de 0,1 M em um recipiente selado a 4 °C durante semanas com pouco prejuízo à preservação. Certifique-se de que há tampão suficiente para evitar a secagem.
9. Incubar as amostras com ácido tânnico recém-preparado em 0,05 M de cacodilato de sódio por 45 min no escuro à temperatura ambiente.
   NOTA: O ácido tânico é irritante e pode causar danos oculares. Use equipamentos de proteção individual adequados e realize o experimento em um capô de fumaça.
10. Realize três lavagens de 5 minutos com ddH₂O antes da desidratação e incorporação.

2. Desidratação da amostra, incorporação de resina de Epon e montagem

1. Prepare a resina Epon de acordo com a seguinte razão por peso (ver passo 2.2). Tare um equilíbrio com um béquer plástico descartável de 100 mL contendo uma barra de agitação. Corte as extremidades de 5 pipetas pasteur de plástico descartável e use-as para transferir componentes viscosos de resina para o béquer.
2. Adicione sequencialmente 19,2 g de resina-812, 7,6 g de DDSA, 13,2 g de MNA e 0,8 g de acelerador DMP-30 no béquer. Usando a quinta pipeta pasteur de plástico limpo, misture completamente os componentes da resina manualmente.
   NOTA: Evite introduzir bolhas, mas garanta a mistura suficiente da resina inferior com a parte superior para obter uma mudança de cor e uma mistura áspera das camadas dos componentes. Todos os componentes da resina são irritantes e são prejudiciais por inalação e contato com a pele. DMP-30 é corrosivo e pode causar corrosão cutânea. Use equipamentos de proteção individual adequados.
3. Coloque o béquer em um agitador magnético e deixe mexer suavemente, misturando periodicamente a resina manualmente.
4. Lave as amostras com agitação suave por 5 min com 70% de etanol; repetir uma vez.
5. Lave as amostras com agitação suave por 5 min com 90% de etanol; repetir uma vez.
6. Lave as amostras com agitação suave por 5 min com 100% de etanol; repetir uma vez.
7. Enquanto as amostras estão em 100% de lavagem de etanol em um capô de fumaça, prepare um óxido de propileno 50:50 (v/v) (PO):Mistura de epon em um frasco de vidro com uma tampa de plástico resistente ao óxido de propileno (PO). Corte com cuidado, mas com segurança na tampa do frasco de vidro, e mantendo a tampa e o frasco, agite ou misture o vórtice.
   NOTA: O óxido de propileno é um irritante gravemente tóxico e inflamável que dissolve alguns plásticos. Use equipamentos de proteção individual adequados e realize o experimento em um capô de fumaça.
8. Após o passo 2.6, incubar as amostras com PO:Epon por 1h em um recipiente resistente a PO (por exemplo, bandejas de alumínio ou frascos de vidro), com balanço/agitação suave no capô da fumaça.
9. No capô da fumaça, transfira as amostras para 100% Epon. Incubar por 2 h à temperatura ambiente no capô da fumaça com balanço/rotação/agitação. Transfira a mistura PO:Epon para uma garrafa de resíduos Epon de vidro dedicada.
10. Repita o passo 2.9 uma vez.
11. Monte as amostras para incorporar. Dependendo do tamanho das fatias e da região de interesse, monte diretamente as fatias em resinas pré-hipnotizadas ou incorpore-as para dissecção e reinscreva-as posteriormente.
    NOTA: Para incorporar plano, um "slide cast-a" pode ser usado para incorporar muitas fatias ao mesmo tempo. As resinas restantes podem ser usadas para encher cápsulas de feixe e assadas para fazer stubs pré-hipnotizados ou congelados para uso posterior.
12. Uma vez montado e coberto com resina suficiente para encher a cavidade "cast-a slide", asse as amostras durante a noite em um forno de 60 °C.
    NOTA: Ponto de pausa potencial. As amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente por anos.
13. Para reinserção, identifique a região de interesse nas fatias de tecido embutido plano. Usando a serra de um joalheiro, corte o pedaço de tecido de tamanho apropriado (1 mm² a 4 mm²) e reincorra usando resina preparada, como na etapa 2.2, no topo de um bloco pré-hipnotizado e asse durante a noite em um forno de 60 °C.
    NOTA: Alternativamente, a peça de tecido pode ser colada a um stub ou pino com resina epóxi de duas partes. Deixe para definir durante a noite. Ponto de pausa potencial.

3. Corte e secção serial de amostras incorporadas

NOTA: A secção é uma habilidade aprendida; os usuários devem ser proficientes na seção ultrathin antes de tentar seção serial. Como os controles exatos de microtome variam entre os fabricantes, siga as instruções e diretrizes do fabricante.

1. Com a amostra presa no adaptador de corte, use uma lâmina de barbear para aparar cuidadosamente o tecido embutido da resina para atender aos seguintes critérios (ver Figura 1A,B):
   1. Certifique-se de que há uma superfície plana e superior expondo o tecido ao redor da região de interesse.
   2. Certifique-se de uma forma trapezoide com as bordas superior e inferior sendo limpas e paralelas.
   3. Assegure-se de dimensões globais de 200-500 μm em x, 100-500 μm em y.
   4. Certifique-se de uma face de bloco assimétrico, por exemplo, cantos laterais direito de ~90 °, obtuso do canto superior esquerdo e canto inferior esquerdo agudo.
      NOTA: Um crioknife de corte pode ser uma ferramenta alternativa para uma lâmina de barbear. As outras recomendações são para a conveniência do usuário para pedir seções ao fotografar. Opcional: Se as seções não formarem fitas estáveis, um cimento de contato pode ser aplicado na borda principal da face do bloco para auxiliar a formação da fita. Lâminas de barbear são afiadas; tome cuidado para segurar a lâmina de barbear de tal forma que deslizamentos acidentais são improváveis de resultar em danos pessoais.

Figura 1: Fluxo de trabalho TEM da seção serial. (A) Diagrama da amostra no bloco de resina. (B) Bloco de aparar para gerar uma forma trapezoide com bordas adequadas para seção serial e face de bloco assimétrico para garantir orientação conhecida. (C) Diagrama mostrando fitas de seções seriais, flutuando na superfície da água no barco da faca de diamante. (D) Diagrama mostrando a organização da seção e da fita, ditando a ordem das seções, em uma grade de ranhura TEM de 3 mm de diâmetro. (E) Imagem e navegação TEM. Mostrando a ordem de fita e seção e usando "adesivos de estrela amarela" no monitor para referências na tela para garantir a reimaginação da mesma região de interesse em seções subsequentes. (F) Alinhamento e corte de imagem. (G) Segmentação, reconstrução 3D e visualização. Abreviação: TEM = microscopia eletrônica de transmissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Uma vez aparado, transfira o arco do espécime, juntamente com o mandril e a amostra, para o braço do espécime do microtoma, posicionando o arco do espécime para que o intervalo de viagem do arco corra de cima para baixo; proteger o arco do espécime no lugar.
3. Coloque e tranque a faca de diamante no porta-faca, garantindo que o ângulo de corte seja definido adequadamente à faca. Tranque o porta-faca no palco com segurança.
4. Com o palco aceso, use o avanço da faca enquanto verifica constantemente a relação entre o rosto do bloco e a borda da faca. Avance com cautela a faca em direção ao espécime, ajustando continuamente o ângulo lateral da faca, inclinação do espécime e rotação do espécime, ajustando os botões relevantes até que o bloco esteja alinhado à borda da faca.
5. Desligue o palco iluminado; ligar o palco para baixo, e, em cima da luz, ele não pode ser definir a parte superior e inferior da janela de corte do braço espécime; e deixar o espécime logo abaixo da borda da faca.
6. Encha o barco da faca com ddH₂O limpo e certifique-se de que a superfície da água esteja nivelada com a borda da faca e apenas ligeiramente côncava.
7. Opcional: Mergulhe um cílio no Triton X-100 de 0,1% e, em seguida, na água do barco da faca para reduzir a tensão superficial da água para ajudar o clorofórmio e a captação da fita.
8. Prepare a estação de trabalho com cílios (cílios colados a uma vara de coquetel), grades de ranhura revestidas de formvar, fórceps cruzados rotulados, clorofórmio, solução Triton X-100 de 0,1%, água destilada, papel filtro e caixa de grade com notas de caixa de grade.
9. Coloque a velocidade de corte em 1 mm/s e a espessura inicial de corte até 100 nm e inicie o ciclo de corte.
10. Após o corte da primeira seção, altere os parâmetros de corte para uma velocidade de corte de 0,8 mm/s e a espessura de corte para 70 nm, e continue cortando, permitindo que as seções formem uma fita movendo-se pela superfície do barco de faca cheio de água (Figura 1C).
    NOTA: É importante estar atento à cor das seções que estão sendo produzidas, pois este é muitas vezes um guia mais preciso para a espessura das seções de resina. As seções prateadas geralmente têm cerca de 70 nm de espessura, enquanto as seções cinzas são mais finas e as seções de ouro são mais grossas.
11. Deixe que o microtome continue cortando seções e a fita fique mais longa.
    NOTA: É importante evitar grandes vibrações e distúrbios físicos no quarto. Os rascunhos podem fazer com que as seções se movam sobre a superfície da água no barco da faca, e vibrações físicas podem fazer com que o microtome corte irregularmente.
12. Uma vez coletadas seções suficientes e antes que a fita chegue ao final do barco, pare o corte (logo após a amostra ter passado a borda da faca).
    NOTA: O número de seções necessárias depende do tamanho da face do bloco e do tamanho do conjunto de dados a ser coletado. Assim, é útil estar ciente da relação entre o tamanho do bloco e a grade de ranhuras à medida que as seções de corte estão saindo.
13. Usando um cílio em cada mão, quebre suavemente a fita em fitas menores que podem caber no comprimento da grade de ranhura, tomando o cuidado de anotar suas posições relativas de dentro da amostra.
    NOTA: Se sua largura combinada se encaixar, várias fitas podem ser suavemente colocadas umas próximas umas das outras e recolhidas juntas em uma única grade de ranhura. Se pegar várias fitas em uma única grade de ranhura, preste atenção à ordem e à posição relativa das fitas. Por exemplo, coloque sempre as fitas mais na amostra à direita de uma fita já na amostra (Figura 1D).
14. Opcional: Usando uma haste aplicadora de vidro, passe uma gota de clorofórmio sobre as seções para achatá-las.
    NOTA: O clorofórmio é tóxico e irritante. Não deixe que o clorofórmio toque na superfície da água ou seções. Se isso acontecer acidentalmente, a água precisa ser removida e a faca lavada antes de retornar à secção. O clorofórmio pode danificar as seções e degradar a cola que prende o diamante no barco da faca.
15. Usando as primeiras fórceps numeradas, pegue a primeira grade de ranhura vazia (no lado direito do slot, formvar lado para baixo), mergulhe suavemente no Tritão X-100 e, em seguida, duas vezes na água destilada antes de remover o excesso de água da borda das fórceps usando um pedaço de papel filtro.
16. Com um cílio em uma mão e os fórceps na outra mão, abaixe suavemente aproximadamente 2/3^da grade de fenda revestida de formvar na água do barco da faca (longe das seções), de modo que o lado formvar esteja voltado para baixo, e a borda longa direita da fenda esteja na superfície da água e paralela à borda da água.
17. Puxe suavemente a grade na água em direção às fitas de modo que, após o curso de retorno, as seções derivam em direção à grade. Continue a fazer isso em wafts cada vez menores até que a borda direita da fita se a linha com a borda direita do slot. Em seguida, com o último waft, leve suavemente a grade para pegar as seções até a grade de ranhura.
18. Deixe a grade nos fórceps para secar antes de armazená-la na caixa de grade, apropriadamente anotada na folha de referência da caixa de grade.
19. Repita o passo 3.16 até que todas as fitas sejam coletadas, garantindo que a ordem das fitas seja mantida.
20. Se forem necessárias outras seções, retire a faca de 150 nm ou mais, verifique o nível da água no barco e adicione mais, se necessário. Inicie novamente o processo de corte, seguindo as etapas 3.11-3.18.
21. Uma vez que todas as seções sejam coletadas, certifique-se de que a borda da faca esteja livre dos detritos da seção, retire a faca da face do bloco e remova e limpe a faca.

4. Coloração da grade

1. Uma vez seco, manche as seções com o citrato de chumbo de Reynolds, seja no parafilme no banco ou em uma placa de Petri. Coloque várias pelotas de hidróxido de sódio sob uma tampa de placa de Petri para fornecer um ambiente livre de dióxido de carbono. Então, com cuidado, longe das pelotas, pipeta 40 μL gotas de citrato de chumbo reynolds no parafilme, um para cada grade.
   NOTA: Não manche muitas grades ao mesmo tempo; por exemplo, o máximo deve ser 6. Tente não respirar diretamente no prato de coloração. O dióxido de carbono pode reagir com o citrato de chumbo e causar precipitação indesejada nas redes.
2. Inverta cada grade (lado da seção para baixo) na queda do citrato de chumbo e deixe protegido pela tampa da placa de Petri por 7 a 10 minutos. Enquanto as grades estão manchando, prepare um segundo pedaço maior de parafilm no banco com cinco gotas de 300 μL de água destilada para cada grade.
3. No final da incubação do citrato de chumbo, transfira cada rede para uma gota de água destilada para lavar por 1 minuto sem respirar diretamente nas grades.
4. Repita o passo 4.3 um total de cinco vezes.
5. Usando fórceps de crossover numerados, pegue a primeira grade, toque na borda da grade para filtrar papel para afastar a maior parte da água e deixe secar nos fórceps (por pelo menos 20 minutos). Repita para cada grade.

5. Aquisição de imagens pela TEM

NOTA: Como os controles TEM exatos variam entre os fabricantes, siga as instruções e diretrizes do fabricante. As seguintes etapas devem ser realizadas por usuários que já são proficientes no uso do TEM.

1. Antes da imagem, realize as verificações usuais, por exemplo, alinhamento do feixe, referências de ganho e eucentricidade da amostra.
2. Carregue cuidadosamente a primeira grade de seções seriais no suporte da amostra, tomando o cuidado de alinhar o slot (e, portanto, seções) ao eixo vertical do estágio do microscópio.
   NOTA: Essa precisão não é essencial, mas economiza tempo durante as fases de aquisição e tratamento de dados futuros. Ao inserir a grade (lado da seção para baixo ou lado da seção para cima), tome cuidado para a imagem de todas as grades na mesma orientação.
3. Na baixa ampliação, observe a ordem, localização e posição das seções seriais (Figura 1E). Navegue até a parte central da série na grade.
   NOTA: Dependendo do objetivo exato da pesquisa, as abordagens para imagem podem variar; no entanto, o seguinte é um ponto de partida útil. A forma das seções e a relação das fitas (como captado na etapa 3.14) ditam qual seção foi a primeira e qual seção foi a última na grade.
4. Navegue pela amostra e identifique uma região de interesse. Observe a amostra na ampliação desejada e considere coletar a série em uma ampliação ligeiramente menor, pois as seções muitas vezes não estão perfeitamente alinhadas, e as imagens podem precisar ser cortadas mais tarde.
5. Faça imagens de referência em ampliações mais baixas para apreciar o contexto da região de interesse, sua localização áspera em diferentes ampliações em relação aos limites da seção e características de referência dentro da amostra. Use-os para registrar a região de interesse em outras seções.
6. Opcional: para referências na tela, use massa adesiva reutilizável, adesivos ou um pedaço de papel projetor aéreo (OHP), colado na tela, para colocar marcadores temporários na tela para permitir a reimaginação de rotina das mesmas características da região de interesse no centro da imagem, ao longo do conjunto de dados (ver estrelas amarelas na Figura 1E).
7. Utilizando as imagens de referência, navegue até a região de interesse na primeira seção da grade e adquira uma imagem na ampliação desejada.
   NOTA: Ao salvar imagens, anote o nome do primeiro arquivo da primeira imagem da série e use nomenclatura de nomeação sequencial para que todos os nomes de imagem sigam a ordem sequencial das seções seriais.
8. Navegue até a próxima seção e repita o passo 5.7 até que todas as seções tenham sido imagens para essa região de interesse.

6. Registro de alinhamento de exportação de imagens e seções seriais

1. Exporte os arquivos de imagem pertencentes à mesma pilha para uma única pasta. Certifique-se de que a pasta está classificada pelo nome do arquivo.
   NOTA: As imagens devem ter o mesmo nome raiz e seguir a ordem em que foram adquiridas.
2. Abra Fiji e clique em Arquivo | | de importação Sequência de imagens.
3. Clique na primeira imagem da pasta e clique em Abrir. Aguarde que uma janela pop-up de Opções de Sequência apareça (Figura 2A).

Figura 2: Criação de uma pilha serial e alinhamento de seção serial usando Fiji. (A) Captura de tela mostrando as Opções de sequência ao carregar as imagens para fazer uma pilha serial. (B) Captura de tela do plugin TrackEM2 e das janelas-chave do plugin. Pressione OK na separação Slice para prosseguir com o alinhamento. (C) Captura de tela após carregar com sucesso a pilha serial no painel de visualização. Três janelas sequenciais de parâmetros de alinhamento aparecerão assim que as fatias de pilha de alinhamento forem selecionadas . Exporte a pilha alinhada assim que o alinhamento estiver concluído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Clique em Classificar nomes numericamente | Converta para opção de 8 bits . Pressione ok.
   NOTA: A conversão para 8 bits auxilia a importação dos dados para Amira e reduz o tamanho do arquivo, permitindo velocidades de processamento mais rápidas em etapas posteriores.
5. Verifique a completude, sequência e ampliação da pilha criada. Salve a pilha criada como um arquivo .tif.
   NOTA: As imagens deveriam ter sido adquiridas na mesma ampliação.
6. Execute o plugin TrakEM2⁴¹. Vá para o Arquivo | Nova | TrackEM2 (em branco).
   NOTA: O plugin pedirá ao usuário para salvar os arquivos TrackEM2. Se necessário, salve os arquivos TrackEM2 na pasta de imagem. Três janelas devem aparecer: uma janela de projeto, uma janela de navegação de pilha (esquerda) e um painel de visualização de pilha (Figura 2B).
7. Clique com o botão direito do mouse no painel de visualização preto. Clique em importar | Importe pilha e selecione a pilha criada anteriormente.
8. Clique em OK para carregar a pilha na janela de navegação stack.
   NOTA: Uma janela de separação Slice aparecerá para pedir o relacionamento entre pixel e dimensão. Para apenas o alinhamento da pilha, clique em OK para pular esta etapa.
9. Use o controle deslizante para verificar todas as fatias da pilha. Procure a fatia carregada, que aparecerá como um patch no plano de navegação. Selecione os patches que serão incluídos no seguinte alinhamento.
   NOTA: As manchas selecionadas ficarão azuis.
10. Passe o mouse sobre o painel de observação. Clique com o botão direito do mouse na imagem, selecione Alinhar | Alinhar fatias de pilha (Figura 2C-1).
11. Especifique os parâmetros de alinhamento através de um conjunto de três janelas sequenciais.
    NOTA: Para a maioria dos dados, comece com um alinhamento rígido (permite rotação e tradução, mas não transformação) e mantenha outros parâmetros como padrão (Figura 2C-2).
12. Deixe que o alinhamento seja executado até que o registro de leitura diga a montagem feita.
    NOTA: O tempo de execução depende do número de voxels e da velocidade do computador.
13. Verifique a pilha alinhada no painel de visualização. Pressione Alt e - teclas (no PC) ou teclas Ctrl e - (em Mac) para uma visão de zoom da pilha alinhada.
14. Se estiver satisfeito com a pilha alinhada, clique com o botão direito do mouse para exportar | Faça uma imagem plana para salvar a pilha alinhada.
15. Selecione a primeira imagem como o início da pilha e a última imagem como o fim da pilha, clique em OK (Figura 2C-3). Salve a pilha alinhada como .tif.
    NOTA: Para reduzir o tamanho do arquivo, corte os dados para conter apenas a região de interesse necessária.
16. Se necessário, execute um alinhamento afim na pilha alinhada. Abra a pilha alinhada em Fiji, selecione Plugin | | de inscrição O StackReg.
17. Escolha a opção affine e pressione OK. Aguarde até que o programa esteja completo.
18. Salve a pilha alinhada com um nome de arquivo diferente.

7. Segmentação e reconstrução 3D

1. Abra Amira⁴². Clique em | de arquivos Abra dados para carregar a pilha alinhada.
2. Especifique as medidas de voxel na nova janela pop-up (Figura 3A).

Figura 3: Segmentação da pilha serial usando Amira. (A) A janela popup de definição Voxel antes de carregar uma pilha alinhada. (B) Captura de tela da interface do projeto após a importação de uma pilha. Selecione a guia Segmentação para iniciar o rastreamento de objetos no painel Editor de Segmentação. (C) Principais características da guia de segmentação. Defina os objetos para segmentação na seção Editor de Segmentação da guia Segmentação. Use a função zoom para auxiliar a identificação de objetos. Selecione a ferramenta Pincel e rastreie o limite do objeto. Clique no símbolo + em Seleção para atribuir o rastreamento. Um objeto atribuído parecerá ter um limite vermelho no painel de visualização ortoslice. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Um nó de pilha de imagens aparecerá na interface do projeto, e uma ortopote aparecerá no painel de visualização à direita (Figura 3B).

3. Para iniciar a segmentação, selecione a Guia de Segmentação (Figura 3B).
   NOTA: Recomenda-se salvar o progresso da segmentação antes e durante a segmentação. Vá para Model | Salve o modelo Como qualquer arquivo .am que se adapte.
4. Clique em Novo no painel do editor de segmentação para definir novos objetos na lista de materiais. Clique com o botão direito do mouse para alterar a cor do objeto e clique duas vezes para renomear o objeto.
5. Para segmentação manual, escolha a ferramenta de segmentação abaixo da lista de material. Selecione a ferramenta brush padrão para destacar os pixels (Figura 3C).
   NOTA: Alternativamente, use a ferramenta pincel para traçar o contorno do objeto e pressione Shift + F para preencher o objeto.
6. Para converter a ferramenta de escova em uma borracha, pressione continuamente o Ctrl enquanto seleciona pixels para correção. Anote cada fatia na pilha.
7. Uma vez confirmado, atribua a seleção a um rótulo clicando no sinal + . Clique no - sinal para remover a seleção.
8. Volte para a interface do projeto assim que a segmentação estiver concluída. Procure um nó com uma extensão ".label" conectada à pilha de imagens.
9. Clique com o botão direito do mouse na extensão ".label" e selecione Gerar | Inscreva-se para criar um arquivo .surf.
10. Para renderizar o modelo 3D de um objeto segmentado, clique com o botão direito do mouse no arquivo .surf e selecione Exibição De superfície para gerar um modelo 3D no painel de visualização.
11. Salve o modelo 3D para visualização ou análises quantitativas adicionais.

Resultados

Para esta técnica, as regiões de interesse são selecionadas com base no objetivo de pesquisa biológica e identificadas antes do corte e secção do tecido incorporado. Da mesma forma, o tamanho da face do bloco pode ser ditado pela questão da pesquisa; neste caso, a amostra foi aparada para deixar uma face de bloco de aproximadamente 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Isso permitiu duas grades de 9 seções seriais por grade, fornecendo 18 seções seriais e incorporando um volume de tecido ...

Discussão

Uma técnica vEM acessível para visualizar a estrutura organela e interações em 3D é descrita neste protocolo. A morfologia dos contatos interorganelle em hepatócitos é apresentada como um estudo de caso aqui. No entanto, essa abordagem também tem sido aplicada para investigar uma variedade de outras amostras e áreas de pesquisa, incluindo interações endoteliais de células schwann em nervos periféricos⁴⁵, biogênese corporal weibel palade em células endoteliais⁴⁶

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Aluminum trays	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
Chloroform	Fisher	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride	TAAB	T027	Epon ingredient
Diamond knife	DiaTOME	ultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol	TAAB	D032	Epon ingredient
Dumont Tweezers N5	Agar Scientific	AGT5293
Fiji			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 plugin			https://imagej.net/
Formaldehyde 36% solution	TAAB	F003
Formvar coated slot grid	Homemade		Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu)
Glass bottle with applicator rod	Medisca	6258
Glass vials	Fisher Scientific	15364769
Gluteraldehyde 25% solution	TAAB	G011
MNA/Methyl Nadic Anhydride	TAAB	M011	Epon ingredient
Osmium Tetroxide 2% solution	TAAB	O005
Potassium Ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene oxide	Fisher Scientific	E/0050/PB08
Reuseable adhesive	Blue Tack
Reynolds Lead Citrate	TAAB	L037	Section stain
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C-0250	to make 0.1 M Caco buffer
Super Glue	RS Components	918-6872	Cyanoacrylate glue, Step 1.3
TAAB 812 Resin	TAAB	T023	Epon ingredient
Tannic acid	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Two part Epoxy Resin	RS Components	132-605	Alternative: Step 2.13
Ultramicrotome	Leica	UC7
Vibrating microtome	Leica		100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude .
Weldwood Original Contact cement	DAP	107	Contact adhesive: Step 3.1.4