Preparação e caracterização de biotinta de hidrogel biohíbrido 3D à base de grafeno para neuroengenharia periférica

Resumo

Neste manuscrito, demonstramos a preparação de uma biotinta hidrogel biohíbrida contendo grafeno para uso em engenharia de tecidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, é realizado o protocolo de diferenciação neural de células-tronco. Este pode ser um passo importante para trazer biomateriais semelhantes para a clínica.

Resumo

Neuropatias periféricas podem ocorrer como resultado de dano axonal e, ocasionalmente, devido a doenças desmielinizantes. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que ocorre em 1,5%-5% dos pacientes de emergência e pode levar a perdas significativas de empregos. Hoje, as abordagens baseadas em engenharia de tecidos, consistindo em arcabouços, linhagens celulares apropriadas e biossinais, tornaram-se mais aplicáveis com o desenvolvimento de tecnologias de bioimpressão tridimensional (3D). A combinação de vários biomateriais de hidrogel com células-tronco, exossomos ou moléculas de biosinalização é frequentemente estudada para superar os problemas existentes na regeneração de nervos periféricos. Nesse sentido, a produção de sistemas injetáveis, como hidrogéis, ou estruturas de condutos implantáveis formadas por diversos métodos de bioimpressão tem ganhado importância na neuroengenharia periférica. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Estas não são células especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta à lesão. O sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado de nicho de células-tronco. Nas lesões nervosas periféricas, especialmente na neurotmese, esse microambiente não pode ser totalmente resgatado mesmo após a ligação cirúrgica das terminações nervosas cortadas. A abordagem de biomateriais compósitos e terapias celulares combinadas aumenta a funcionalidade e aplicabilidade dos materiais em termos de várias propriedades, como biodegradabilidade, biocompatibilidade e processabilidade. Nesse sentido, este estudo tem como objetivo demonstrar a preparação e o uso de padrões de hidrogel biohíbrido à base de grafeno e examinar a eficiência da diferenciação de células-tronco em células nervosas, o que pode ser uma solução eficaz na regeneração nervosa.

Introdução

O sistema nervoso, que é o mecanismo que faz a ponte entre a estrutura interna do organismo e o ambiente, é dividido em duas partes: o sistema nervoso central e o periférico. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que constitui 1,5%-5% dos pacientes que chegam ao pronto-socorro e se desenvolve devido a vários traumas, levando à perda significativa do emprego ^1,2,3.

Atualmente, as abordagens celulares da neuroengenharia periférica são de grande interesse. As células-tronco vêm em primeiro lugar entre as células usadas nessas abordagens.....

Protocolo

1. Cultura de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton

1. Retire as células-tronco mesenquimais gelatinosas da Wharton (WJ-MSCs, da ATCC) de um freezer de -80 °C. Culturas de CTMs-WJ em meio DMEM-F12 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de Pen-Strep e 1% de L-glutamina em fluxo laminar estéril à temperatura ambiente, conforme descrito em Yurie et ^al.20.
2. Criopreservar algumas células a 1 x 10⁶ células/mL com meio de congelamento contendo 35% FBS, 55% DMEMF-12 e 10% dimetil sulfóxido (DMSO). Para isso, conte 1 x 10⁶ células em uma lâmina de contagem de células Thoma e adicio....

Resultados

Toxicidade do grafeno e imagens 2D
A análise estatística dos resultados obtidos do MTT foi realizada com ANOVA one-way com teste de Tukey em software de análise estatística, e o gráfico obtido encontra-se na Figura 2. A porcentagem de grafeno em relação ao controle apresentou decréscimo significativo apenas para a concentração de grafeno a 0,001% (**p < 0,01). Não houve diferenças significativas entre os demais grupos e o controle (p > 0,05). Portanto, a conce.......

Discussão

As vantagens dos tratamentos aplicados com andaimes 3D projetados em relação aos métodos 2D convencionais estão se tornando cada vez mais perceptíveis a cada dia. Células-tronco usadas isoladamente nessas terapias ou em conjunto com arcabouços produzidos a partir de vários biomateriais com baixa biocompatibilidade e biodegradabilidade são geralmente inadequadas na regeneração de nervos periféricos. As células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ) parecem ser uma linhagem celular candidata adeq.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifugal	Hitachi		Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2	HD Bioink		Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter	Aιsιmo		Used for sterilization
0.45 µm syringe filter	Aιsιmo		Used for sterilization
1.5mL conic tube	Eppendorfa		Used for bioink drop
15mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
3D Bioprinting	Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey)		Bioprinting Step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit	Santa Cruz Biotechnology	J1514	Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat	Santa Cruz Biotechnology	C3109	Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600	Leica		for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM	Quanta	FEG 450	for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder	HD Bioink		Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs	Virostem		Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2)	Grafen Chemical Industries Co.		Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin)	Cell Signalling and Santa Cruz		Used for dye
JASCO 6600	Tetra		for FTIR
MTT Assay	Sigma		Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide	Isolab		Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System	Zeiss Axio.Observer.Z1		Imaging
Tripsin-EDTA	Multicell		The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks	Biobase		For produced bioink step
WJ-MSCs	ATCC		Used for the cell culture process