Preparação do tecido miocárdio humano para cultivo a longo prazo

Resumo

Apresentamos um protocolo para o cultivo ex vivo de tecido miocárdio ventricular humano. Permite uma análise detalhada da força de contração e cinética, bem como a aplicação de carga pré e posterior para imitar o ambiente fisiológico in vivo mais de perto.

Resumo

O cultivo de cardiomiócitos tem visto um grande número de desenvolvimentos, desde o cultivo de células bidimensionais (2D) até organoides derivados do iPSC. Em 2019, foi demonstrada uma forma ex vivo de cultivar fatias de miocárdio obtidas a partir de amostras de coração humano, ao mesmo tempo em que se aproximava da condição in vivo de contração do miocárdio. Estas amostras são originárias principalmente de transplantes cardíacos ou colocações de dispositivos de assistência à esquerda. Utilizando um vibratome e um sistema de cultivo especialmente desenvolvido, fatias de 300 μm de espessura são colocadas entre um fio fixo e um fio de mola, permitindo um cultivo estável e reprodutível por várias semanas. Durante o cultivo, as fatias são continuamente estimuladas de acordo com as configurações individuais. Contrações podem ser exibidas e registradas em tempo real, e agentes farmacológicos podem ser prontamente aplicados. Os protocolos de estimulação definidos pelo usuário podem ser agendados e realizados para avaliar parâmetros vitais de contração, como potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário. Além disso, o sistema permite uma configuração variável de pré e pós-carga para um cultivo mais fisiológico.

Aqui, apresentamos um guia passo-a-passo sobre como gerar um cultivo bem-sucedido a longo prazo de fatias de miocárdio ventricular esquerdo humano, utilizando uma solução comercial de cultivo biomimético.

Introdução

Na última década, o cultivo in vitro de células miocárdias fez grandes avanços, desde técnicas 2D e tridimensionais (3D) até o uso de organoides e células-tronco pluripotentes induzidas diferenciadas em miócitos cardíacos ^1,2,3. Os cultivos de ex vivo e células primárias têm se mostrado de grande valor, especialmente para estudos genéticos e desenvolvimento de medicamentos ^4,5,6. O uso de tecidos humanos melhora o valor translacional dos resultados. O cultivo 3D a longo prazo de tecidos miocárdios com geometria intacta, no entanto, não é bem estabelecido. A geometria intacta é uma característica fundamental para imitar condições in vivo, já que a função cardíaca adequada, a comunicação entre diferentes células, bem como as interações entre matriz celular são pré-requisitos. O cultivo de tecido miocárdio passou por várias fases de desenvolvimento. A taxa de sucesso e a estabilidade do cultivo de tecido miocárdio ex vivo foram inicialmente bastante baixas, mas abordagens recentes produziram resultados promissores^de 7,8,9,10,11.

Entre eles, Fischer et al. foram os primeiros a demonstrar que a viabilidade e o desempenho contítil do tecido miocárdio humano podem ser mantidos no cultivo de células ex vivo por muitas semanas⁷. Sua técnica foi baseada em fatias finas de tecido cortadas do miocárdio humano explantado, que foram montadas em câmaras de cultivo recém-desenvolvidas que forneceram condições biomecânicas definidas e estimulação elétrica contínua. Este método de cultivo se assemelha muito à função in vivo do tecido miocárdio, e foi reproduzido por vários grupos de pesquisa independentes 2,12,13,14,15. É importante ressaltar que as câmaras utilizadas por Fischer et al. também permitiram o registro contínuo de forças desenvolvidas por até 4 meses, e assim abriram oportunidades inéditas para pesquisas fisiológicas e farmacológicas sobre miocárdio humano^{intacto 7}.

Técnicas semelhantes foram desenvolvidas independentemente por outros grupos e aplicadas ao miocárdio humano, rato, suíno e coelho ^7,10,11. Pitoulis et al. desenvolveram posteriormente um método mais fisiológico, que reproduz a relação normal de comprimento de força durante um ciclo de contração, mas é menos adequado para análise de alto rendimento¹⁶. Como tal, a abordagem geral do cultivo biomimético pode ser considerada como mais um passo para a redução, refinamento e substituição (3R) de experimentos animais.

No entanto, a exploração desse potencial requer procedimentos padronizados, análises de alto conteúdo e um alto nível de rendimento. Apresentamos uma técnica que combina o corte automatizado do miocárdio humano vivo com a manutenção in vitro em um sistema de cultivo biomimético que se tornou comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Com a abordagem proposta, o número de fatias individuais que podem ser geradas a partir de uma única amostra miocárdia transmural é limitado apenas pelo tempo de processamento. Uma amostra de tamanho e qualidade suficientes (3 cm x 3 cm) muitas vezes produz 20-40 fatias de tecido sendo convenientemente cortadas com um vibratome automatizado. Essas fatias podem ser colocadas em câmaras de cultivo pertencentes ao sistema. As câmaras permitem estimulação elétrica, cujas parâmetros podem ser moduladas (ou seja, duração do pulso, polaridade, taxa e corrente), bem como o ajuste da pré e pós-carga, utilizando fios de mola dentro das câmaras. A contração de cada fatia é registrada a partir do movimento de um pequeno ímã ligado a um fio de mola e exibido como um gráfico interpretável. Os dados podem ser registrados o tempo todo e analisados usando software livremente disponível. Além do ritmo constante da linha de base, protocolos programados podem ser realizados para avaliar funcionalmente seu período refratário, limiar de estimulação, potencialização pós-pausa e relação de frequência de força.

Este cultivo biomimético de longo prazo de múltiplas fatias de miocárdio de um coração individual abre caminho para futuras pesquisas ex vivo em tecido humano e animal, e facilita a triagem para efeitos terapêuticos e cardiotóxicos de drogas na medicina cardiovascular. Já foi aplicado em diversas abordagens experimentais 2,12,13,15. Aqui, damos uma descrição detalhada passo a passo da preparação do tecido humano e fornecemos soluções para problemas de cultivo frequentemente encontrados.

Protocolo

A coleta de tecidos para os experimentos aqui descritos foi aprovada pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Munique e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.

1. Aquisição de tecidos

1. Obtenha tecido humano de pacientes submetidos a transplante de coração ou cirurgia cardíaca.
2. Antes de obter o tecido, prepare 2 L de solução cardioplégica (ainda chamada de tampão de corte (Tabela 1)).
3. Após obter uma biópsia ventricular transmural (LV) de 4 cm x 4 cm de tamanho, coloque o tecido imediatamente (dentro de 5 minutos após a excisão) em um béquer estéril de plástico closable contendo aproximadamente 70 mL de tampão de corte frio (4 °C). Mantenha a 4 °C.
   NOTA: O tampão de corte utilizado neste protocolo permite o armazenamento a frio (4 °C) do tecido por até 36 h. Isso permite o transporte frio do tecido de clínicas que não estão próximas ao laboratório. No entanto, os tempos de transporte ≤ 24 h provaram ser ótimos.

2. Preparação agarose e vibratome

1. Certifique-se de que as câmaras de cultivo suficientes sejam preparadas e esterilizadas (Figura 1A).
   1. Submergir as câmaras e eletrodos de grafite em 1 L de uma solução isopropanol de 10% e agitar durante a noite. No dia seguinte, transfira as câmaras para uma solução de isopropanol 100% por 3 min e autoclave os eletrodos de grafite a 120 °C por 10 min.
   2. Deixe as câmaras e eletrodos de grafite secarem sob um capô de fluxo laminar.
   3. Conecte uma placa de circuito a cada uma das câmaras de acordo com as posições disponíveis no roqueiro. Coloque dois eletrodos de grafite na placa de circuito de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Coloque uma tampa de placa de Petri de 35 mm em cima da câmara para evitar contaminação.
2. Configure o sistema de cultivo Myodish (ver Tabela de Materiais) em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ conectando o sistema a um computador (Figura 1B).
3. Prepare a 4% de baixa derretimento em tampão de corte (sem glicose; Tabela 2). A agarose pode ser armazenada a 4 °C por 6 meses.
   1. No dia do experimento, derreta um volume de estoque de solução agarose usando um banho de água a 80 °C. Dependendo da quantidade, o derretimento leva aproximadamente 30 minutos.
   2. Quando a agarose for líquida, elasenhe 8 mL de líquido em uma seringa de 10 mL, com um adicional de 2 mL de ar. Feche a seringa com uma tampa estéril e coloque-a de cabeça para baixo em um banho de água de 37 °C por 20 minutos, para evitar que a agarose se solidifique e equilibre sua temperatura para evitar danos de hipertermia da amostra.
4. Se presente, ligue o dispositivo de resfriamento de água do vibratome pelo menos 30 minutos antes do corte tecidual para permitir capacidade de resfriamento suficiente. Coloque a temperatura da circulação da água para 4 °C.
   NOTA: A bandeja de corte e a placa de resfriamento utilizada aqui continham uma circulação de água embutida. Isso é altamente recomendado para resfriamento e para diminuir os riscos de contaminação. No entanto, também é possível usar o gelo como técnica de resfriamento. Além disso, o dispositivo de resfriamento de água não precisa ser conectado à bandeja de corte do vibratome e/ou placa de resfriamento neste ponto do protocolo.
5. Limpe a bandeja de fatiamento do vibratome e a placa de amostra, lavando todas as superfícies com isopropanol 100% por pelo menos 3 minutos.
   NOTA: Dependendo do sistema vibratome utilizado, a configuração do vibratome pode diferir. Consulte o manual do vibratome presente no laboratório para obter informações sobre os métodos de configuração e calibração da lâmina.
6. Encha a bandeja de corte até 90%-95% com tampão de corte. Na configuração atualmente utilizada, isso corresponde a aproximadamente 400 mL. Conecte a tubulação do dispositivo de resfriamento de água às válvulas da bandeja de corte do vibratome e da placa de resfriamento.
7. Desinfete todas as ferramentas necessárias para a preparação submergindo-as em uma solução de isopropanol 100% para 5 s. Remova as ferramentas da solução isopropanol e seque ao ar sob o capô de fluxo laminar.

3. Aparar e incorporar as amostras

1. Transfira a amostra de tecido para uma placa de Petri de 100 mm cheia de tampão de corte frio. Mantenha o prato em uma placa de resfriamento a 4 °C (conectado ao refrigerador ou colocado no gelo).
2. Remova a trabecula do endocárdio segurando o endoárdio com pinças e usando uma tesoura para cortar aproximadamente 3 mm de tecido endocárdio. Da mesma forma, remova o tecido adiposo excessivo sob o epicárdio se estiver presente.
3. Fixar a amostra de tecido cortado, lado do endocárdio para cima, a um patch de borracha de 2 cm x 2 cm usando quatro agulhas de 0,9 mm x 70 mm 20 G fixadas em posição quadrada (0,9 cm x 0,9 cm; Figura 1C, D). Certifique-se de que a borda diagonal de cada ponta da agulha está apontando para dentro. Isso aumenta a fixação e evita danos ao miocárdio.
   ATENÇÃO: A orientação do quadrado acima mencionado deve ser ortogonal à direção predominante de miofibra esperada.
4. Corte todo o excesso de tecido fora do quadrado de quatro agulhas usando um bisturi. Se o tamanho da amostra original permitir, use duas amostras de tecidos miocárdios durante esta preparação da mesma amostra bruta.
5. Usando pinças, coloque a amostra aparada em um pedaço de tecido estéril para remover qualquer excesso de tampão de corte deixado na amostra. Para evitar a secagem da amostra, não mantenha a amostra no tecido por mais de 10 s.
6. Coloque a amostra em uma placa de Petri de 35 mm, de tal forma que a lâmina corte perpendicularmente ao alinhamento do cardiomioco e o epicárdio esteja voltado para baixo. Se a preparação incluir duas amostras, certifique-se de que as amostras estão centradas e não se toquem.
7. Pegue a seringa agarose do banho de água e submerse a amostra em agarose. (Figura 2A). Deixe a agarose solidificar por 5 minutos em uma placa de resfriamento. A amostra deve manter contato com a placa de Petri, o que garantirá que o plano de corte será paralelo à direção predominante da fibra miocárdia.
   ATENÇÃO: Não esvazie totalmente a seringa, a fim de evitar bolhas de ar. Preste atenção à quantidade de agarose que é deixada na seringa durante o submerso das amostras. No caso de bolhas de ar no prato com as amostras, puxe cuidadosamente bolhas de ar de volta para a seringa.

4. Colocar as amostras na bandeja de corte

1. Remova a agarose solidificada contendo a amostra(s) da placa de Petri de 35 mm usando uma espátula ou ferramenta semelhante, tecendo-a entre a amostra e o lado da placa de Petri. Corte parte da agarose usando um bisturi enquanto mantém as amostras cobertas.
   ATENÇÃO: Não remova muito da agarose. Deve haver pelo menos 5 mm de agarose nos lados longos e curtos no plano X/Z.
   NOTA: As etapas 4.2-4.4 precisam ser realizadas em rápida sucessão (ou seja, máximo de 5 s). Tenha todas as ferramentas necessárias ao alcance antes de iniciar. Nenhum reposicionamento da amostra é possível após a colocação. Tente limitar a exposição da cola ao ar e à umidade. O contato com o ar ou fluidos solidificará a cola, tornando-a inutilizável.
2. Com uma pipeta, coloque e distribua 60 μL de cola dentro e ao redor do centro da plataforma de corte.
3. Coloque o lado epicárido da amostra contida em agarose em cima da área colada usando pinças. Não reposicione. O lado endocárdio da amostra deve ser visível na agarose. Deixe a cola solidificar por 1 min. Pressione suavemente a agarose contendo a amostra da parte superior com uma ferramenta sem corte (por exemplo, pinças) enquanto evita cortar ou danificar a ágarose.
4. Coloque a plataforma de amostra em sua posição designada na bandeja de corte do vibratome, preenchida com tampão de corte.

5. Começando o vibratome

1. Defina amplitude de vibração para 1 mm e a velocidade inicial de corte para 0,07 mm/s. Coloque a espessura da fatia em 300 μm para cortar fatias.
2. Desde que a lâmina corte apenas a agarose, aumente a velocidade de corte ao máximo, que neste caso é de 1,50 mm/s. Assim que o vibratome começar a cortar o tecido, diminua a velocidade para 0,07 mm/s imediatamente.
   NOTA: Se o tecido não for fatiado sem problemas, por exemplo, se houver grandes áreas fibrosas na amostra, pode ajudar a aumentar a amplitude de corte até 1,5 mm e reduzir a velocidade de corte para 0,04 mm/s.

6. Preparação média e incubadora durante o procedimento de corte

1. Encha cada câmara de cultivo com 2,4 mL de meio de cultivo completo (Tabela 3).
2. Coloque as câmaras de cultivo preenchidas com médio no sistema de cultivo na incubadora fixada em 37 °C, 5% CO₂, 21% O₂ e umidade de 80%. Equilibre o meio por pelo menos 20 minutos.
3. Conecte o sistema de cultivo com um computador e inicie o programa de software correspondente.
4. Defina a velocidade do roqueiro a 60 rpm e predefinir os parâmetros de estimulação (pulsos de estimulação e frequência). Para fatias cardíacas humanas, defina a estimulação padrão para impulsos bifásicos com corrente de 50 mA, cada uma composta por corrente positiva de 3 ms, uma pausa de 1 ms e um pulso de 3 ms de corrente invertida, a uma taxa de ritmo de 30 batidas por minuto (BPM).
   NOTA: Em tecidos bem preservados, o limiar típico de estimulação é de cerca de 15 mA. Para garantir uma estimulação confiável e para explicar qualquer possível aumento do limiar de estimulação, recomenda-se definir a corrente para um valor que exceda o limiar de estimulação em duas a três vezes.
5. Verifique os indicadores de eletrodos do software para verificar se os eletrodos das câmaras de cultivo estão funcionando corretamente.
   NOTA: Ação é necessária sempre que o indicador de canal no software de cultivo fica vermelho. Neste caso, as cargas de pulso bipolar não são equilibradas.

7. Preparando as fatias

NOTA: As fatias subendocardiais iniciais não são comumente adequadas para o cultivo de tecidos e precisam ser descartadas devido à morfologia desigual. Após as primeiras cinco a 10 fatias, a textura da fatia e a morfologia melhoram. A fatia ideal é de pelo menos 1 cm x 1 cm, não tem ou apenas manchas fibrosas limitadas, não é fragmentada e tem alinhamento de fibras homogêneas (Figura 2B, D). A fibrose intersticial, localizada entre as fibras do miócito, está frequentemente presente na falha do miocárdio humano. Surpreendentemente, este não é um preditor negativo do sucesso do cultivo.

1. Despeje uma quantidade adequada de tampão de corte frio em uma tampa de placa de Petri de 5 cm para garantir que as fatias não sequem. Coloque as fatias na tampa da placa de Petri contendo o tampão de corte frio.
2. Separe a ágarose do tecido usando pinças. Evite tocar no tecido. Manuseie o tecido cuidadosamente, pois qualquer dano ao tecido reduzirá a taxa de sucesso do cultivo.
3. Determine a direção das fibras do miocárdio por uma inspeção minuciosa contra uma fonte de luz. Isso é importante ao fixar os triângulos plásticos ao tecido na etapa 7.6.
   NOTA: As etapas 7.4 e 7.5 precisam ser realizadas em rápida sucessão, dentro de 5 s.
4. Conecte dois triângulos plásticos a uma amostra usando cola para ancorar o tecido dentro das câmaras de cultivo.
   1. Coloque 1 μL de cola em uma tampa estéril da placa de Petri. Use uma pinça ligada para pegar um dos triângulos plásticos autoclavados. Mergulhe rapidamente a borda frontal do triângulo na cola e cole o triângulo na amostra, perpendicular ao alinhamento do cardiomiócito. Repita para o outro triângulo.
5. Corte o tecido que exceda a largura do triângulo com um bisturi (Figura 2C). Coloque a fatia com os dois triângulos montados de volta no tampão de corte da bandeja de corte.
   NOTA: Repita as etapas 7,2 a 7,5 até que sejam preparadas fatias suficientes para encher as câmaras de cultivo. Recomendamos preparar algumas fatias adicionais para permitir a substituição de fatias por contração ruim.

8. Montagem das fatias

NOTA: A carga posterior é determinada pela rigidez do fio de mola nas câmaras de cultivo. Três tipos diferentes estão disponíveis, com base na espessura do fio de mola.

1. Pegue uma câmara de cultivo de preenchimento médio da incubadora. Selecione uma das fatias preparadas e insira-a na câmara conectando um triângulo a cada pino.
2. Ajuste a distância entre os pinos de montagem de acordo com o tamanho da amostra. Certifique-se de que a amostra está submersa em meio. Coloque a câmara de volta em seu soquete designado do sistema de cultivo na incubadora.
   ATENÇÃO: Não estique demais o tecido e não dobre demais o fio de mola!
3. Coloque a tensão de pré-carga após a colocação do prato no roqueiro.
   1. Diminua a pré-carga girando o parafuso de ajuste no sentido anti-horário. Faça isso até que a linha de base do gráfico correspondente na tela do computador não mude mais.
   2. Aumente cuidadosamente a pré-carga (ou seja, aumente a tensão) girando o parafuso de ajuste no sentido horário. Para as câmaras com maior rigidez, continue até que a linha de base correspondente no gráfico tenha aumentado em 1000-1200 unidades, o que corresponde a 1 mN de pré-carga.
      NOTA: O ajuste exato dependerá da constante de mola individual de uma câmara de cultivo, que pode ser determinada pela calibração antes de um experimento de acordo com as instruções do fabricante. O software de gravação permite a consideração da calibração individual da câmara para que as forças sejam exibidas uniformemente em μN. Recomenda-se aplicar estimulação elétrica desde o início do cultivo. Como tal, é bem possível que a fatia comece a contrair durante o ajuste de pré-carga. Neste caso, concentre-se na linha de base diastólica para avaliar a pré-carga.

9. Mudando o meio

1. Prepare o meio de cultivo de acordo com a receita na Tabela 3. Pouco antes do uso do meio, adicione 50 μL de β-mercaptoetanol (50 mM) a um tubo de 50 mL. Armazenar a 4 °C.
2. Uma vez a cada 2 dias, troque parcialmente o meio de cultivo. Refrescar o meio a cada 2 dias, se desejar o cultivo a longo prazo das fatias do miocárdio.
3. Pré-aqueça o meio fresco em banho-maria ou incubadora de ar quente a 37 °C por 30-45 min. Remova uma câmara de cultivo da incubadora e coloque-a sob uma coifa de fluxo laminar.
   ATENÇÃO: É essencial manter a câmara, assim como o médio, aquecido a 37 °C (> 35 °C) para evitar hiperconduções devido à baixa temperatura. Danos menos distintos podem estar presentes como um aumento da tensão diastólica dentro de poucas horas após a troca média. Isso pode parecer se recuperar, mas o estresse repetido pode resultar em deterioração acumulada.
4. Retire o meio da câmara de cultivo, deixando aproximadamente 0,8 mL na câmara. Adicione 1,6 mL de meio fresco à mesma câmara. O volume total de médio deve ser de cerca de 2,4 mL por câmara.
5. Coloque a tampa da câmara de volta e coloque a câmara de cultivo de volta em sua respectiva posição.

Resultados

A contração das fatias do miocárdio foi exibida na tela do computador após a inserção da câmara de cultivo em seu conector correspondente (Figura 3). A contração das fatias do miocárdio humano começou imediatamente após a estimulação. As fatias hipercontratadas por 5-10 min. Isso foi visível como um aumento das forças diastólicas, causadas por uma contratura tônica de frações de tecido danificadas. Esse processo foi revertido para diferentes graus dentro de 1-1,5 h. Após...

Discussão

No passado, a pesquisa cardiovascular fez grandes avanços no cultivo de cardiomiócitos. No entanto, o cultivo 3D de cardiomiócitos com geometria intacta ainda não está bem estabelecido. Em comparação com os protocolos anteriores aplicados para o cultivo ex vivo do tecido miocárdio, o protocolo que descrevemos aqui se assemelha mais ao ambiente in vivo do tecido. Além disso, a aplicação de pré e pós-carga permite um ambiente mais biomimético. Somos capazes de analisar e entender completamen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish culture system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070