Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave

Resumo

Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.

Resumo

Atualmente, a tecnologia de cultura organoide cerebral ainda é complicada de operar e difícil de aplicar em larga escala. É necessário encontrar uma solução simples e prática. Portanto, um protocolo organoide cerebral mais viável é proposto no presente estudo. Para resolver o inevitável inconveniente na mudança média e na transferência organoide no estágio inicial, a pesquisa atual otimiza a tecnologia de operação aplicando o princípio da engenharia. Uma lâmpada de luz macia foi adotada para iluminar lateralmente as amostras do corpo embrionário (EB), permitindo que os EBs fossem vistos a olho nu através do efeito de reflexão difusa aprimorado. Utilizando o princípio do fluxo secundário gerado pela rotação, os organoides se reúnem em direção ao centro do poço, o que facilita o funcionamento de mudança média ou transferência organoide. Comparado com a célula dispersa, o corpo embrionário se instala mais rápido na pipeta. Usando este fenômeno, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem ser efetivamente removidos de forma simples, impedindo que os EBs incorram em danos causados por centrifugação. Este estudo facilita o funcionamento da cultura organoide cerebral e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais.

Introdução

Em comparação com sistemas de cultura bidimensionais (2D), sistemas de cultura tridimensionais (3D) têm várias vantagens, incluindo replicação genuína e reprodução eficiente de estruturas complexas de determinados órgãos¹. Portanto, organoides cerebrais são um dos importantes métodos auxiliares para os campos de pesquisa do desenvolvimento cerebral humano e da doença², rastreamento de drogas e terapia celular.

A colheita de organoides cerebrais pelo método de suspensão rotativa é propícia ao seu desenvolvimento e maturação³. Embora os sistemas de cultura organoide cereb....

Protocolo

O protocolo foi conduzido após a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (Revisão Médica e Ética [2021] Nº 022). Antes do experimento, cada meio foi preparado de acordo com a fórmula¹² de Juergen A. Knoblich (Tabelas Suplementares 1-4), ou um Kit Organoide Cerebral comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Os iPSCs utilizados neste estudo foram previamente estabelecidos pelo nosso laboratório e obtiveram isenção informada. Os SCA3-iPSCs foram gerados a partir de uma ataxia spinocerebellar fêmea de 31 ano....

Resultados

O presente estudo induziu iPSCs (Figura 2B) em organoides cerebrais (Figura 2C). Os EBs cultivados na fase inicial expressaram o marcador OCT4 (Figura 2A), que indicava boa pluripotência. No estágio posterior, os EBs desenvolveram-se em organoides cerebrais maduros (Figura 2D). A pesquisa cultivou iPSCs de indivíduos saudáveis normais e pacientes SCA3 em organoides cerebrais (Fi.......

Discussão

Organoides cerebrais abrem novos caminhos para a pesquisa médica. Muitas aplicações úteis desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas²⁸. Esta pesquisa constatou que os resultados de sequenciamento de transcritos de organoides cerebrais geneticamente doentes e organoides cerebrais normais podem refletir as diferenças entre doença e saúde. Por exemplo, os resultados da análise de dados do RNA-seq (Figura 3B) são consistentes com muitos estudos re.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/