Uma abordagem microfluídica para o estudo da cristalização de hidratos de gelo e clatrato

Resumo

O presente protocolo descreve a cristalização de cristais de gelo microscópicos e hidratos de clatratos em dispositivos microfluídicos, possibilitando a troca líquida ao redor dos cristais formados. Isso fornece possibilidades incomparáveis para examinar o processo de cristalização e os mecanismos de ligação dos inibidores.

Resumo

Uma descrição mecanicista precisa da cristalização da água é um desafio e requer alguns elementos-chave: excelente controle de temperatura para permitir a formação de cristais microscópicos únicos e um sistema de microscopia adequado acoplado ao estágio frio. O método aqui descrito acrescenta outra característica importante que inclui a troca de soluções em torno de cristais de gelo e clatrato hidratado. O sistema descrito compreende uma combinação de instrumentos únicos e desenvolvidos em casa, incluindo microfluídica, estágios frios de alta resolução e microscopia de fluorescência. O estágio frio foi projetado para dispositivos microfluídicos e permite a formação de cristais de gelo/hidrato do tamanho de mícrons dentro de canais microfluídicos e a troca de soluções em torno deles. A resolução da temperatura e a estabilidade do estágio frio é de um milikelvin, o que é crucial para controlar o crescimento desses pequenos cristais. Este sistema diversificado é usado para estudar os diferentes processos de cristalização de gelo e hidrato e o mecanismo pelo qual o crescimento desses cristais é inibido. O protocolo descreve como preparar dispositivos microfluídicos, como cultivar e controlar cristais microscópicos nos canais microfluídicos e como a utilização do fluxo de líquidos em torno de cristais de gelo / hidrato proporciona novos insights sobre a cristalização da água.

Introdução

As proteínas anticongelantes (AFPs) e as glicoproteínas anticongelantes (AFGPs) protegem vários organismos adaptados ao frio dos danos causados pela geada¹. AFPs e AFGPs (generalizados como AF(G)Ps) inibem o crescimento de cristais de gelo, ligando-se irreversivelmente às suas superfícies e inibindo o crescimento adicional devido ao efeito Gibbs-Thomson 2,3,4,5. A lacuna resultante que se forma entre a temperatura de fusão, que é em grande parte inalterada, e a temperatura de congelamento recém-deprimida é chamada de histerese térmica (TH) e representa um parâmetro mensurável correspondente à atividade da AFP⁶. O uso de AFPs para inibir o crescimento do gelo tem aplicações de longo alcance e diversas, oferecendo aprimoramento potencial em vários campos, incluindo criopreservação, qualidade de alimentos congelados e proteção de culturas expostas ao frio.

A cristalização da água a baixas temperaturas e altas pressões na presença de pequenas moléculas orgânicas resulta na formação de hidratos de clatratos (ou hidratos gasosos), onde o hidrato mais abundante é o hidrato de metano⁷. A cristalização de hidratos de metano em linhas de fluxo de gás/óleo pode causar plugues, o que pode causar explosões devido à ignição do gás ^8,9,10. Os esforços atuais para prevenir a cristalização de hidratos em linhas de fluxo incluem o uso de inibidores termodinâmicos (álcoois e glicóis) e cinéticos (principalmente polímeros) ^11,12,13,14. Verificou-se também que as AFPs se ligam aos cristais de hidrato de clatratos e inibem seu crescimento, o que aponta para o uso potencial de AFPs para dificultar a formação de tampões, proporcionando assim uma solução mais verde¹⁵.

A microfluídica é um método prevalente utilizado para estudar as propriedades de fluidos em volumes de amostra minúsculos (até fL) que são fluídos através de uma rede de microcanais¹⁶. Os microcanais seguem um padrão criado em uma bolacha de silício (o molde) utilizando litografia¹⁷. Um material comumente usado para fabricar dispositivos microfluídicos é o polidimetilsiloxano (PDMS), que é barato e relativamente simples de trabalhar em laboratórios de pesquisa. O design dos recursos (canais) é composto em relação à finalidade específica do dispositivo; assim, pode ser utilizado para uma variedade de aplicações, incluindo detecção de DNA¹⁸, diagnóstico médico¹⁹ e processos de cristalização 3,20,21.

O presente protocolo descreve um método microfluídico único de cultivo de cristais de gelo e hidrato do tamanho de mícrons com vários inibidores, incluindo AFPs e AFGPs. Para esses experimentos, hidratos de tetraidrofurano (THF) foram utilizados para mimetizar as propriedades dos hidratos gasosos de metano²², que requerem equipamentos especializados para controle de pressão e temperatura²³. AF(G)Ps marcados fluorescentemente foram utilizados para visualizar e analisar a adsorção das proteínas à superfície cristalina e, juntamente com imagens fluorescentes, a abordagem microfluídica permitiu a obtenção de características-chave do processo de ligação dessas moléculas às superfícies cristalinas.

Protocolo

1. Fabricação de dispositivos microfluídicos

1. Cubra a superfície interna de uma placa de Petri com papel alumínio e coloque o molde pré-preparado na placa de Petri.
   1. Fabricar os moldes utilizando as técnicas de litografia descritas nas referências. Os dois projetos de dispositivos utilizados no presente trabalho estão representados na Figura 1.
2. Preparar 30-40 ml da mistura PDMS pesando uma mistura 1:10 (em peso) do agente de cura e do elastômero (ver Tabela de Materiais) e misturando continuamente por aproximadamente 5 minutos até que a mistura pareça branca e quase opaca.
   NOTA: Coloque um copo de plástico na balança, despeje o elastômero no copo e, em seguida, adicione o agente de cura para obter uma proporção de peso de 1:10.
3. Despeje a mistura PDMS na placa de Petri com o molde e desgaseifique em um exsicador até que não restem bolhas (aproximadamente 30 min).
4. Asse o molde com o PDMS líquido num forno ou numa placa quente a 70 °C até obter uma consistência semelhante a borracha. Esse processo leva cerca de uma hora.
5. Corte o dispositivo traçando as características com um bisturi, tomando o cuidado de avançar com o bisturi em vez de para baixo, uma vez que o molde é frágil. Remova o dispositivo PDMS recortado, colocando-o de cabeça para baixo em uma nova placa de Petri. Remova a poeira e as partículas de sujeira da superfície inferior anexando e removendo um pedaço de fita adesiva (consulte Tabela de materiais).
6. Use uma agulha de seringa contundente (20 G) para perfurar furos no dispositivo com base no padrão impresso, usando um microscópio, se necessário. Certifique-se de que o orifício penetra pelo outro lado do dispositivo e use uma pinça para remover as peças perfuradas.
7. Lave cuidadosamente uma folha de cobertura (18 x 18 mm, 0,14 mm de espessura) com água e sabão e, em seguida, com isopropanol. Use a pressão do ar para secar a tampa limpa.
8. Insira o PDMS limpo e a tampa no limpador a plasma, feche as válvulas e ligue a energia, o aspirador e a bomba. Permita que o limpador de plasma funcione por cerca de um minuto, defina o RF como HI e permita que um pouco de ar entre no limpador de plasma usando a válvula fina.
   1. Quando a cor da janela de visualização mudar de roxo para rosa, deixe o limpador de plasma trabalhar por 50 s e desligue a RF. Mantenha a bomba ligada por um minuto e, depois de desligá-la, abra gradualmente a válvula principal para permitir que o ar entre no limpador de plasma.
      NOTA: Um método alternativo para alcançar resultados comparáveis é a ligação térmica. Para este método, coloque o molde sobre a tampa e coloque-o em uma placa quente ajustada a 70-80 °C por aproximadamente 60 min.
9. Pressione a superfície do PDMS sobre a tampa limpa e confirme que eles estão colados observando que não há descolamento ao puxar ligeiramente para cima na tampa.
10. Prenda a agulha de uma agulha contundente de 90° (18 G) com um par de alicates e retire o conector da seringa de plástico para removê-la. Insira uma extremidade da agulha em um tubo Tygon (0,020" ID, 0,060" OD, consulte Tabela de materiais) e a outra extremidade em um dos orifícios perfurados do dispositivo. Repita o processo para os outros furos.
11. Para remover bolhas de ar, injete água/tampão nos canais com uma seringa de vidro (uma bomba é opcional, mas nenhuma bomba foi usada aqui). Filtre todos os líquidos com um filtro de 0,22 μm antes de os injetar no dispositivo.
12. Use um agente bloqueador, como uma solução de BSA a 1%, para evitar a ligação de AFPs marcadas com fluorescência nas paredes do PDMS. Injete o agente bloqueador no canal de entrada e deixe-o permanecer nos microcanais por 20 minutos. Em seguida, injete a solução tampão no canal de entrada para liberar a solução BSA.
    NOTA: O dispositivo PDMS resultante é anexado a uma tampa ao longo de sua superfície inferior, conectado à tubulação em seus orifícios de entrada e saída e revestido com um agente bloqueador em seus canais.

2. Configuração do dispositivo microfluídico

1. Aplique uma pequena quantidade de óleo de imersão na superfície do estágio frio de cobre (consulte Tabela de materiais) e espalhe-o usando um lenço sem fiapos para criar uma fina camada de óleo. Em seguida, coloque um disco de safira limpo (consulte Tabela de materiais) na camada de óleo criada. Aplique uma gota de óleo de imersão no centro do disco de safira e posicione o dispositivo PDMS na gota de modo que as características do dispositivo estejam alinhadas sobre o orifício de visualização do estágio frio.
2. Segure o dispositivo no lugar e prenda a tubulação às paredes externas da caixa de alumínio que abriga o estágio frio usando fita adesiva. Anote a colocação de cada tubo específico.
3. Utilize uma seringa de vidro para injetar 4-5 μL de solução de AF(G)P (ver Tabela de Materiais) no canal de entrada. Feche a tampa do estágio frio.
   NOTA: A concentração das soluções de AFP pode ser variada e decidida com base na sua intensidade de fluorescência. No presente protocolo, a faixa de concentrações foi de 5-40 μL.

3. Formação de cristais únicos nos canais microfluídicos

1. Purge o estágio frio com ar seco / nitrogênio para evitar a formação de condensação dentro dele. Ative um banho de resfriamento circulante para circular a água através do estágio frio e servir como um dissipador de calor.
2. Inicie o programa de controle de temperatura e defina a temperatura para -25 °C.
   NOTA: O congelamento ocorrerá à medida que a amostra atingir uma temperatura de ~-20 °C, que pode ser observada como um escurecimento e rugosidade súbitos da amostra. Qualquer objetivo pode ser usado neste ponto, de preferência o objetivo 4x, que permite ao usuário observar a totalidade dos canais microfluídicos.
3. Lentamente, aumentando a temperatura em aproximadamente 1 °C/5 s, aproximam-se do ponto de fusão da amostra, que pode variar de -1 a -0,2 °C, dependendo do tampão utilizado na solução de AF(G)P. À medida que a temperatura se aproxima do ponto de fusão, espere até que alguns cristais únicos sejam isolados.
   NOTA: Se necessário, o gelo indesejado pode ser derretido localmente usando um laser IR (980 nm) (ver Tabela de Materiais), que é fixado no microscópio. O laser derrete cristais de gelo próximos, desde que esteja ligado.
4. Neste ponto, recomenda-se mudar para objetivos de 10x ou 20x para observar melhor os cristais únicos. Depois de obter um único cristal no local desejado, aumente o cristal diminuindo ligeiramente a temperatura (em ~0,01 °C) até que as bordas do cristal encontrem as paredes do canal.
5. Mude para o objetivo de 50x, injete a solução AF(G)P nos canais e observe o aumento da intensidade de fluorescência, indicando que a solução proteica foi injetada com sucesso nos canais. Execute esta etapa com cuidado para evitar o derretimento do cristal de gelo durante a troca de soluções. Monitorize e ajuste de perto o caudal (aplicando mais/menos pressão na seringa de vidro) e a temperatura durante o processo de troca de solução.
6. Permita que as proteínas tenham tempo suficiente para se acumular e se ligar à superfície do cristal.
   NOTA: Isso varia de acordo com as taxas de acumulação e adsorção do AF(G)P ^5,25. Em um experimento típico, 5-10 min são permitidos para o acúmulo de AFP

4. Medição da atividade da histerese térmica (HT)

Observação : esta etapa é opcional.

1. Determine o ponto de fusão do cristal ajustando a temperatura com pequenos passos de 0,002 °C e observando a temperatura mais alta a que um pequeno cristal pode ser submetido sem derreter.
2. Na função RAMP do controlador de temperatura, defina a taxa de resfriamento para -0,05 a -0,01 °C/4 s e ative o RAMP. Observe a temperatura exata na qual ocorre o crescimento súbito do cristal.
   NOTA: Este valor é chamado de temperatura de ruptura e corresponde à temperatura de congelamento. A diferença entre as temperaturas de fusão e congelamento é a atividade TH²⁵.

5. Troca de soluções em torno de cristais únicos

1. Certifique-se de que a temperatura da amostra esteja no intervalo TH para evitar o derretimento ou crescimento do cristal durante o experimento.
2. Registre o processo de troca de soluções usando o programa de imagem NIS Elements (consulte Tabela de materiais) para posterior análise de dados de fluorescência. Injete lentamente a solução tampão na segunda entrada do dispositivo microfluídico e observe uma diminuição no sinal fluorescente a uma taxa que depende da pressão aplicada à seringa.
   1. Use essa representação visual para garantir que a pressão aplicada não seja muito alta para não causar o derretimento do cristal. Consulte a Figura 2 para obter uma sequência de imagens que demonstram o processo de troca de soluções.
3. Meça a intensidade de fluorescência no canal microfluídico usando o programa de imagem.
   NOTA: O sinal deve atingir o pico na região próxima à superfície do cristal, indicando ligação AFP, e deve ser relativamente baixo na solução circundante, que foi lavada com tampão.
4. Meça a atividade de TH após a troca de soluções seguindo a etapa 4.
5. Repita o experimento isolando um novo cristal (etapas 3.3-3.5). Injetar a solução de AFP com uma seringa de vidro e repetir a troca da solução (passos 5.1-5.3). Obter um novo cristal único (passos 3.3-3.5) e fluir a solução de AFP para os canais utilizando a seringa de vidro.

6. Experimentos com hidratos de clatratos

1. Para obter hidratos de THF, prepare uma solução de THF/água com uma relação molar de 1:15, que é uma relação de volume de 1:3,3²⁶. Manter esta proporção em todas as soluções utilizadas nas experiências seguintes, incluindo as que contêm AF(G)Ps ou outros inibidores.
2. Siga os passos 1 e 2 para preparar o dispositivo microfluídico e colocá-lo na fase fria. Ajuste a temperatura para -25 °C; a amostra congelará a ~-20 °C, conforme descrito no passo 3.2.
3. Depois que a solução de THF estiver congelada, aumente lentamente a temperatura até que todo o gelo tenha derretido.
   NOTA: O ponto de fusão do gelo é ligeiramente deprimido pelo THF.
4. Para garantir que todos os cristais de gelo derreteram com a exclusão dos hidratos, mantenha a temperatura a 1 °C durante 3 min.
5. Ajuste a temperatura para -2 °C e observe a abundância de hidratos que aparecem nos canais microfluídicos na ausência de inibidores.
   NOTA: Os hidratos THF são moldados como octaedros (Figura 2) e, em alguns casos, os cristais são muito finos; portanto, a observação clara pode ser um desafio. Nestes casos, recomenda-se repetir os passos 6.4-6.5 para obter novos cristais.
6. Injetar o inibidor de AF(G)P/no canal microfluídico utilizando a seringa de vidro enquanto ajusta a temperatura para garantir que os cristais obtidos não derretam/crescem. Aguarde alguns minutos para que as moléculas inibidoras adsorvam na superfície do cristal.
7. Se necessário, meça a atividade de HT após a etapa 4.
8. Troque a solução em torno dos cristais, conforme descrito nas etapas 5.2-5.3.

Resultados

Troca de soluções com cristais de gelo
Uma troca de solução bem-sucedida em torno de um cristal de gelo é apresentada na Figura 3. O carimbo de data/hora em cada snapshot indica que a troca de soluções foi relativamente rápida; no entanto, uma troca mais lenta é possível. A intensidade de fluorescência proveniente das moléculas AFGP adsorvidas de gelo é claramente observada após a troca estar completa (Figura 3, à direita). Uma análise quantitativa da concentração de AFP na superfície do gelo é monitorada usando uma ferramenta designada de região de interesse (ROI) (Figura 4). Neste experimento⁴, utilizou-se AFP tipo III (isoforma QAE) diluída em Tris-HCl de 50 mM (pH 7,8) e NaCl de 100 mM. A solução é trocada em torno de um cristal em forma bipiramidal, e a intensidade de fluorescência na solução e no gelo é monitorada. O gráfico vermelho que indica o sinal de fluorescência na solução é diminuído por um fator de 100 durante a troca da solução, enquanto o sinal calculado (gráfico verde) na superfície do gelo permanece constante. O sinal calculado das moléculas adsorvidas de gelo foi obtido subtraindo-se o sinal proveniente da solução (multiplicado por uma constante que se relaciona com a espessura do canal microfluídico) do sinal proveniente do gelo⁴.

Troca de soluções com hidratos THF
Experimentos microfluídicos com hidratos de THF foram realizados de forma semelhante aos experimentos com gelo. Depois que os cristais de hidrato foram autorizados a adsorver as moléculas inibidoras da solução, uma solução livre de inibidores foi injetada nos canais. A Figura 5 apresenta os hidratos de THF após troca de solução com dois tipos de inibidores: AFGP_1-5 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 5A) e safranina O (ver Tabela de Materiais), que é um corante de fluorescência²⁶ (Figura 5B). Esta é a primeira demonização de uma ligação AFGP à superfície de um hidrato de clatratos.

Figura 1: Representação esquemática dos canais microfluídicos utilizados no presente estudo. Ambos os projetos incluem duas entradas e uma saída. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Hidratos de THF formados no canal microfluídico após o resfriamento da temperatura a ~-2 °C. A morfologia de todos os cristais apresentados é um tetraedro; no entanto, alguns cristais são orientados de forma diferente. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Um experimento representativo exibindo troca de solução em torno de um único cristal de gelo em um canal microfluídico. Inicialmente, a solução continha AFGP_1-5 marcada com FITC, e AFGPs adsorvidos de gelo não foram observados. Depois que a solução foi trocada por uma solução livre de AFGP, as proteínas que haviam sido previamente adsorvidas à superfície do gelo foram claramente detectadas (imagem à direita). Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Uma análise quantitativa e qualitativa da concentração de AFP na superfície do gelo. (A) Um cristal de gelo em alta concentração de solução de AFP (antes da troca de solução). (B) O mesmo cristal após a troca da solução de AFP por uma solução-tampão isenta de AFP. Barra de escala = 20 μm. (C) Análise quantitativa da intensidade de fluorescência na superfície do gelo (preto) e na solução (vermelho) durante uma troca de solução. A curva verde representa a intensidade calculada na superfície do gelo. A figura é adaptada com autorização da referência⁴. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Cristais de hidrato de THF simples em canais microfluídicos após a troca da solução ao seu redor (A, AFGP_1-5) ou (B,Safranine  O). A imagem em (B) é reproduzida a partir da referência²⁶. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O presente protocolo foi projetado para utilizar a combinação de fluxo microfluídico com cristais microscópicos, a fim de revelar novos insights sobre o crescimento de cristais e sua inibição. Um estágio frio²⁷ com temperatura controlada com resolução milikelvina permite o controle de cristais microscópicos únicos situados dentro de canais microfluídicos, permitindo assim a troca de soluções em torno deles. Embora a fabricação de dispositivos microfluídicos seja padrão e semelhante às práticas comuns^17,18, o controle sobre o crescimento e o derretimento de cristais dentro do dispositivo é único e novo. O componente mais crítico neste sistema é o excelente controle de temperatura, que é alcançado usando resfriadores termoelétricos Peltier, feedback de um termistor localizado perto da amostra e um controlador de temperatura de alta resolução que governa o loop de feedback.

Outra etapa crítica é a própria troca de solução, pois os cristais podem derreter ou crescer durante esse processo; assim, a temperatura deve ser ajustada durante a troca de solução para evitar o crescimento/fusão. A formação de cristais em canais microfluídicos interfere no fluxo de líquidos e representa o principal desafio deste sistema; assim, o crescimento desses cristais deve ser controlado. Aqui, um laser IR (980 nm) foi montado no microscópio invertido e foi utilizado para derreter localmente gelo indesejado/hidratar cristais²⁸. Se tal laser não puder ser usado, os conectores metálicos do dispositivo microfluídico podem ser aquecidos por um resfriador termoelétrico Peltier adicional, que derreterá o gelo na entrada / saída do dispositivo.

O método descrito aqui inclui instrumentos desenvolvidos em casa (estágio frio) e requer treinamento, pois algumas das etapas acima mencionadas são desafiadoras. Como a concentração da solução ao redor dos cristais pode mudar mesmo quando o fluxo não é pretendido, uma simples etapa de calibração 5 pode fornecer uma estimativa confiável da concentração com base no sinal^de fluorescência. Outra possível solução para o fluxo indesejado (durante as medições de HT, por exemplo) são as válvulas microfluídicas, que são descritas na referência⁴.

Esse sistema também foi utilizado para explorar o comportamento de crescimento dogelo D 2 O em líquido H₂O, um estudo que revelou um novo fenômeno de superfícies de gelo microscópicas e recortadas²⁷. Assim, a microfluídica pode ser usada no estudo de vários sistemas cristalinos que respondem bem às mudanças de temperatura.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-micron filters	Fisher Scientific
90-degree bent blunt needles			18 Gauge
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins	A gift		See references 5 and 28
Blunt needles			18 Gauge and 20 Gauge
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich
Cold stage	Home made
Cover slips	Globe Scientific		18 X 18 mm, 0.14 mm thickness
Glass syringe
Infrared laser 980 nm	Opto Engine LLC
Inverted microscope, Eclipse Ti - S	Nikon
Invisible tape	Staples
lint-free wipe	Kimwipes
Newport 3040 temperature controller	Newport
NIS-Elements Imaging Software	Nikon
Oil vacuum pump	Harrick Plasma
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit)	Dow Corning Syglard
Safranine O	Sigma-Aldrich	S2255-25G
Sapphire disc	Ted Pella Inc	16005-1010	25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness
sCMOS Camera, Neo 5.5	Andor
Tetrahydrofuran (THF)	Sigma-Aldrich	401757-100ML
Tygon Microbore tubing for microfluidic device	Cole-Parmer		0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll.
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas	Cole-Parmer		1/8” ID, 3/16” OD