Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

Resumo

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para sintetizar os blocos de construção de microgel para andaime de partículas de annealed microporoso, que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicamentos regenerativos.

Resumo

A plataforma de andaimes de partículas renasal (MAP) microporos é uma subclasse de hidrogéis granulares. É composto por um chorume injetável de microgels que podem formar um andaime estruturalmente estável com porosidade em escala celular in situ após um passo secundário de crosslinking químico baseado em luz (ou seja, ressarcir). O andaime MAP tem mostrado sucesso em uma variedade de aplicações de medicina regenerativa, incluindo cicatrização de feridas dérmicas, aumento de dobra vocal e entrega de células-tronco. Este artigo descreve os métodos de síntese e caracterização de microgésis poli (etileno glicol) (PEG) como os blocos de construção para formar um andaime MAP. Esses métodos incluem a síntese de um macromer de enraizamento personalizado (MethMAL), determinação de cinética de gelação precursora de microgel, fabricação de dispositivos microfluidos, geração microfluidica de microgel, purificação de microgel e caracterização básica do andaime, incluindo dimensionamento de microgel e enraizamento de andaimes. Especificamente, os métodos microfluidos de alta produtividade descritos aqui podem produzir grandes volumes de microgel que podem ser usados para gerar andaimes MAP para qualquer aplicação desejada, especialmente no campo da medicina regenerativa.

Introdução

A plataforma de andaime MAP é um biomamaterial injetável composto inteiramente de micropartículas de hidrogel (microgésis) que fornecem microporosidade em escala celular quando interligadas, o que permite migração celular independente da degradação e integração de tecido a granel¹. Devido à sua capacidade de integrar-se rapidamente com o tecido hospedeiro e a imunogenicidade inerentemente baixa, a plataforma de andaime MAP demonstrou aplicabilidade pré-clínica para uma ampla variedade de terapias medicinais regenerativas 2,3,4,5,6,7,8,9,10, incluindo aceleração da cicatrização de feridas dérmicas ^{1,3 11}, revascularizando a cavidade do derrame cerebral⁷, fornecendo células-tronco mesenquimais², e fornecendo volume de tecido para tratar insuficiência glotática⁶. A MAP também tem sido demonstrada para transmitir efeitos anti-inflamatórios para hospedar tecidos através do recrutamento de macrófagos M2³ e pode até mesmo ser sintonizado para promover uma resposta imune th2 "reparação tecidual"⁸. Essas propriedades favoráveis da plataforma de andaime MAP permitem que ela seja expandida para uma gama diversificada de aplicações clínicas.

Métodos publicados anteriormente para geração de microgéis para formação de andaimes MAP incluíram gotículas-microfluidics com foco de fluxo ^1,4,7,9, eletros rezando ^5,12 e fiação aérea com emulsão em lote ^6,10. O método microfluido gotícula pode produzir partículas com alta monodispersidade, mas usa taxas de fluxo muito lentas que produzem baixos rendimentos de partículas (μL/h). Alternativamente, os métodos de emulsão eletros e em lote podem produzir um alto volume de partículas, mas com alta polidispersidade de partículas. Este protocolo utiliza um método microfluido de alto rendimento para produzir microgels com uma população monodisperse, com base no trabalho de De Rutte et al¹³. Este método utiliza técnicas de litografia macia para fazer um dispositivo microfluido de polidimtilsiloxano (PDMS) a partir de um fotomask, que é então ligado a um slide de vidro. O design do dispositivo conta com a emulsificação de passos para gerar um alto volume de partículas de microgel (mL/h). A monodispersidade que pode ser alcançada com este método proporciona um controle superior da porosidade em comparação com outras técnicas, uma vez que microgéis monodisperses podem formar andaimes com tamanhos de poros mais uniformes².

Os métodos de sintetização e caracterização dos microgéis individuais que podem atuar como blocos de construção para andaimes MAP são descritos dentro deste manuscrito, especificamente em termos de criação de microgels que consistem em uma espinha dorsal PEG com um grupo de maleimida (MAL), que prontamente participa da adição eficiente do tipo Michael com crosslinkers estacionários para gelação de microgel. Para desvincular a gelação de microgel da map scaffold annealing, este manuscrito também descreve como sintetizar um macromer de annealing personalizado^{de 14} , MethMAL, que é um macromer PEG heterofuncional/maleimida de 4 braços. Os grupos funcionais de metanfetamina participam prontamente da fotopolimerização livre-radical (para recozimento de microgel), mantendo-se relativamente inertes às condições que promovem a adição do tipo Michael para os grupos funcionais MAL.

Além disso, este manuscrito descreve os protocolos para a criação de dispositivos microfluidos PDMS, determinando cinética de gelação de microgel e caracterizando o tamanho do microgel. A parte final do manuscrito detalha o enlatado map, que é quando os microgels são transicionados in situ em um andaime a granel através de um passo secundário, foto-iniciado crosslinking que covalentemente une as superfícies dos microgels. É importante notar que existem outros métodos de ressaramento que podem ser implementados em sistemas de andaimes MAP que não dependem de químicas baseadas em luz, como o ressarem mediado por enzimas, como descrito anteriormente¹. No geral, esses métodos podem ser usados diretamente ou usados com diferentes químicas de formulação de hidrogel (por exemplo, à base de ácido hialurônico) para gerar andaimes MAP para qualquer aplicação.

Protocolo

1. síntese de macromer de relagem methMAL

NOTA: Este protocolo é especificamente para modificar 1 g de PEG-maleimide, mas pode ser dimensionado para fazer lotes maiores.

1. Adicione 1 g de 4 braços 20 kDa PEG-maleimide a 10 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS, pH 7.4) em um pequeno copo de vidro com uma barra de mexida. Mexa a solução a 300 rpm até que o PEG esteja totalmente dissolvido (~30 min).
2. Adicione 14,65 mg de 2-aminoetanotanol (0,67:1 thiol [SH] à relação molar maleimida [MAL] à reação com agitação a 300 rpm.
   NOTA: Os grupos de thiol em 2-aminoetanotanol serão adicionados a aproximadamente três braços do PEG-MAL via adição tipo Michael, deixando grupos finais de amina.
   1. Observe o seguinte cálculo de exemplo para a quantidade de 2-aminoetanotanol para adicionar:
      
      
      
      NOTA: Para evitar medir uma quantidade muito pequena, dissolva 100 mg de 2-aminoetanotanol em 1 mL de 1x PBS (pH 7.4) e adicione 146,5 μL dessa solução à reação.
3. Aguarde 1h e 10 min após o passo 1.2., depois misture 160,1 mg de 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-cloreto de metilmorfódio (DMTMM, 12:1 molar razão para PEG) e 32,77 μL de ácido metacrílico (8:1 molar razão para PEG) em 5 mL de 1x PBS (pH 7.4) em um novo copo de vidro e reagem por 50 min com agitação a 300 rpm.
   NOTA: Nesta etapa, o ácido metacrílico reage com DMTMM para formar um éster altamente reativo que pode então ser acoplado aos grupos de amina disponíveis no PEG.
   1. Observe o seguinte cálculo de exemplo para calcular a quantidade de DMTMM a adicionar:
      
      
      
   2. Observe o seguinte cálculo de exemplo para calcular a quantidade de ácido metacríclico a acrescentar:
      
      
      
      
4. Adicione a solução de ácido metacríclico/DMTMM ao béquer com a solução PEG-MAL/2-aminoetanol de 20 kDa.
5. Adicione 53,56 μL de trietilamina (proporção molar 1:1 ao ácido metacrílico) ao béquer e deixe reagir durante a noite com agitação a 300 rpm. Cubra o béquer com papel alumínio para evitar que a poeira e outros contaminantes entrem no béquer.
   1. Observe o seguinte cálculo de exemplo para a quantidade de trietilamina a adicionar:
      
      
6. Transfira a reação para tubos de diálise de pele de cobra (corte de peso molecular: 3.500 Da).
7. Coloque a tubulação de diálise em um grande béquer com 1 M NaCl em água deionizada (DI) (volume deve cobrir a tubulação inteiramente) por 3 dias com agitação a 300 rpm. Altere a solução 1 M NaCl 2x diária para um total de seis lavagens.
8. Dialisar por 6 h em água DI. Troque a água DI a cada hora para um total de seis lavagens.
9. Transfira a reação para um tubo cônico de 50 mL e congele a −80 °C.
10. Lyophilize o tubo por pelo menos 72 h a uma temperatura inicial de −70 °C e uma rampa de temperatura de 0,01 °C/min até 0 °C.
11. Prepare a amostra para ¹H-NMR dissolvendo 25 mg de MethMAL em 700 μL de clorofórmio-d e transfira para um tubo NMR.
12. Adquira o espectro ¹H-NMR.
    NOTA: Os espectros deste protocolo foram adquiridos utilizando um espectrômetro de 500 MHz com os seguintes parâmetros: largura de varredura = 6.467,3 Hz, tempo de atraso = 13,1 s, tempo de aquisição = 5,1 s, tempo de pulso = 5,1 μs e número de varreduras = 8.
13. Para análise, integre o pico de maleimida como referência (~6,76 ppm) e, em seguida, integre os dois picos de metanfetamina (~5,35 ppm e 5,6 ppm). Divida a proporção das áreas de pico de metanfetamina pela área total dos três picos para obter a porcentagem de braços modificados com metanfetamina.
    NOTA: Uma modificação aceitável é a substituição do grupo funcional de 67%-75% de methacrilamida. Um exemplo ^deespectro H-NMR para MethMAL é mostrado na Figura 1.
    1. Use a equação (1) como o grau da equação de substituição:
       (1)

Figura 1: Estrutura química e ^{espectro 1}H-NMR de MethMAL. (A) Estrutura química: o macromer de realagem MethMAL é composto de policol de 4 braços de 20 kDa (etileno glicol) modificado com três braços de metacrilamida. (B) Esta estrutura gera picos de 5,36 ppm (3) e 5,76 ppm (2) não presentes no espectro PEG-MAL, e um braço maleimide, que gera um pico de 6,71 ppm (1). O solvente, clorofórmio, gerou um pico de 7,26 ppm, e a água residual nesta amostra gerou um pico de 2,2 ppm (rotulado em espectro). Nos espectros methMAL, o pico de maleimídeos teve uma área integrada de 0,27, e a soma das áreas de picos de metanfetamina foi de 0,73 (0,37 + 0,36). A modificação percentual de metanfetamina foi de 73% (0,73/(0,27 + 0,73)). Este número é de Pfaff et ^al.14. Copyright (2021) American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cinética de gelação precursora de microgel

NOTA: O tempo de gelação pode ser modificado ajustando o pH do buffer usado para dissolver os componentes precursores do gel. Para os hidgel-maleimídeos PEG-maleimida, um pH mais ácido normalmente corresponde ao tempo de gelação mais lento, uma vez que a concentração de tiaolato é diminuída em pH¹⁵ mais baixo.

1. Predetermine as concentrações desejadas de polímeros, crosslinker e outros componentes precursores de gel (ou seja, peptídeos, glicóglicanos). Dissolva o PEG-MAL, RGD e MethMAL (PEG-backbone) em PBS 10x (pH 1.5) e o crosslinker MMP-2 em 1x PBS (pH 7.4).
   NOTA: Neste protocolo, a solução precursora do gel é uma formulação^{publicada 3}, que consiste em 45,88 mg/mL peg-MAL de 4 braços (10 kDa), 0,82 mg/mL RGD, 8,06 mg/mL MethMAL e 4,62 mg/mL MMP-2 crosslinker (enzimaticamente degradável crosslinker).
2. Prepare um viscometro, ou um instrumento equivalente, para monitorar o armazenamento e perda moduli usando um tamanho de lacuna de 0,4 mm, uma cepa de cisalhamento de 1,0, uma frequência de 1,0 Hz e uma duração de 10.800 s.
   1. Fixar uma geometria de rotor de placa de 35 mm (P35/Ti). Use uma câmara umidificada ou uma esponja úmida ao redor da geometria para manter um ambiente umidificado.
   2. Misture a espinha dorsal PEG e o MMP-crosslinker em uma proporção volumosa de 1:1.
   3. Pipeta 400 μL da solução precursora de gel no centro do estágio viscométrico.
   4. Abaixe lentamente a geometria para o palco até atingir o tamanho de lacuna predeterminada de 0,4 mm e comece imediatamente a monitorar o armazenamento (G') e a perda (G'') moduli por até 6 horas à temperatura ambiente.
      NOTA: A gelação é considerada para começar quando o módulo de armazenamento se torna maior do que o módulo de perda, e a gelação é considerada completa quando o módulo de armazenamento platô. Uma curva de cinética de gelação representativa é mostrada na Figura 2.

Figura 2: Curva representativa da cinética de gelação de uma solução precursora de gel MAP (pH 4.5) determinada por um viscometro. A gelação começa com o rápido aumento do módulo de armazenamento (G') e a gelação se completa quando o planalto da curva G. G'' indica o módulo de perda. Este número é de Pruett et ^al.3. Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Fabricação de dispositivos microfluidos

NOTA: Este protocolo descreve a fabricação do dispositivo de um design microfluidic step-emulsification dispositivo adaptado de de Rutte et ^al.13, que pode ser visto na Figura 3A. No entanto, este protocolo pode ser usado com qualquer design de dispositivo que seja gravado em um wafer SU-8. Recomenda-se terceirizar a fabricação mestre do wafer de silício SU-8, a menos que as instalações de limpeza apropriadas estejam disponíveis para fabricação.

1. Crie o primeiro dispositivo microfluido de polidimtilsiloxano (PDMS) a partir de um fotomask de wafer SU-8.
   1. Prepare ~200 g de PDMS misturando a base e o agente de cura em uma proporção de 10:1 w/w (ver a Tabela de Materiais).
   2. Coloque o wafer SU-8 em um prato de cultura (fita as bordas do wafer para o prato), com o design microfluido voltado para cima.
   3. Despeje PDMS no prato para criar uma camada de 1-1,5 cm de espessura sobre o wafer. Coloque o prato sob vácuo para remover quaisquer bolhas.
   4. Deixe o PDMS curar até solidificar (24 h em temperatura ambiente ou ~2 h a 60 °C).
   5. Uma vez que o PDMS tenha curado, use cuidadosamente uma lâmina de barbear ou um bisturi para cortar um retângulo através do PDMS, de tal forma que haja uma margem de 0,5-1 cm em torno do design no wafer.
      NOTA: Não use muita pressão e seja muito gentil para evitar danificar (por exemplo, quebrar, arranhar) o wafer.
   6. Coloque uma espátula em um dos cortes e deslize-a ao longo dos cortes para separar o PDMS do wafer.
      NOTA: À medida que o PDMS se separa do wafer, uma bolha de ar começará a se formar sob o PDMS (consulte a Figura 3B).
   7. Use a espátula para tirar suavemente o retângulo de PDMS do prato.
      NOTA: A lacuna resultante no PDMS acima do wafer será o molde para os dispositivos microfluidos.
2. Crie dispositivos microfluidos PDMS subsequentes a partir da fotomasmak de wafer SU-8.
   1. Prepare ~15-20 g de PDMS por molde misturando a base e o agente de cura em uma proporção de 10:1.
   2. Despeje pdms na abertura retangular no molde para criar uma camada de PDMS de 5 mm acima do wafer. Coloque o molde sob vácuo para remover quaisquer bolhas.
   3. Deixe o PDMS curar até solidificar totalmente (24 h em temperatura ambiente ou 2h a 60 °C).
   4. Uma vez que o PDMS tenha curado, use uma lâmina de barbear ou um bisturi para cortar o PDMS ao redor das bordas do retângulo.
      NOTA: Não use muita pressão e seja muito gentil para evitar danificar (ou seja, rachar) o wafer.
   5. Coloque uma espátula em um dos cortes e deslize-a ao longo dos cortes para separar o PDMS do wafer.
      NOTA: À medida que o PDMS se separa do wafer, uma bolha de ar começará a se formar sob o PDMS.
   6. Use um perfurado de biópsia de 1,5 mm para criar furos através do retângulo PDMS nas duas entradas e saída (consulte a Figura 3B).
   7. Se houver vários dispositivos em um único wafer, use uma espátula ou lâmina de barbear para marcar levemente o PDMS entre cada dispositivo e dobre suavemente o PDMS ao longo das linhas pontuadas para que o PDMS se separe muito limpo por conta própria.
   8. Armazene os dispositivos PDMS em um recipiente sem poeira.
3. Conecte os dispositivos microfluidos PDMS a lâminas de vidro.
   1. Prepare um slide de vidro por dispositivo microfluido PDMS. Use fita, ar filtrado ou lavações de álcool isopropílico (IPA) para remover qualquer poeira do slide. Certifique-se de que os slides estão completamente secos antes de passar para o próximo passo.
   2. Coloque um slide de vidro e um dispositivo PDMS, lado a design para cima, ao lado um do outro em uma pequena bandeja de plástico (uma tampa de placa de 96 poços funciona bem para isso) e coloque-o em um limpador de plasma. Feche a porta e a válvula de fluxo de ar e ligue a bomba de vácuo. Deixe-o correr por pelo menos 30 s, em seguida, desligá-lo.
   3. Conecte o tubo de gás do tanque de oxigênio à válvula de fluxo de ar. Deixe a câmara de plasma encher com oxigênio por 30 s, depois desligue o oxigênio e feche a válvula de fluxo de ar.
   4. Ligue a bomba de vácuo e coloque o nível de radiofrequência (RF) alto. Espere até que a câmara vire uma cor violeta-rosa (consulte a Figura 3B). Deixe passar 30 s.
   5. Quando o temporizador se apagar, desligue o plasma e o vácuo. Em seguida, abra lentamente a válvula de fluxo de ar para liberar o vácuo. Remova a bandeja do limpador de plasma.
   6. Vire suavemente o dispositivo PDMS sobre a lâmina de vidro para relacioná-los. À medida que a ligação acontece, observe a pequena diferença na transparência do PDMS.
      NOTA: Para obter os melhores resultados, armazene os dispositivos ligados a 60 °C até imediatamente antes de usar.
4. Tratamento superficial dos dispositivos microfluidos PDMS
   1. Prepare o tratamento superficial diluindo PFOCTS (tricloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silane) em óleo Novec (1:50). Use 1 mL para dispositivos 3-4. Transfira o volume para uma seringa de 1 mL e conecte uma agulha de 25 G.
      NOTA: As agulhas utilizadas neste protocolo são chanfradas, por isso tome cuidado ao manusear os sharps. Agulhas cegas também podem ser usadas se desejarem.
   2. Corte um pedaço de tubo Tygon de 10-12 cm por dispositivo que será tratado.
   3. Corte um pedaço de tubo PEEK, ~7 cm de comprimento. Insira um par de milímetros da tubulação PEEK na extremidade da tubulação de Tygon, como mostrado na Figura 4A, para ajudar a evitar que a agulha puncte as entradas de tubos de Tygon.
   4. Tire o(s) dispositivo da câmara aquecida e insira a extremidade não PEEK da tubulação Tygon no orifício aquoso da entrada.
   5. Insira a agulha da seringa de tratamento de superfície na tubulação PEEK e cubra o orifício de saída da câmara de óleo (consulte a Figura 3B).
   6. Injete o tratamento no dispositivo lentamente e certifique-se de que ele encha o dispositivo, sem bolhas. Aguarde as câmaras aquosas para encher primeiro, seguido pelos canais menores, e depois pela câmara de óleo. Remova a tubulação Tygon do dispositivo. Uma vez que o dispositivo tenha sido preenchido, deixe descansar por 10 minutos em temperatura ambiente.
   7. Encha uma seringa de 5 mL apenas com óleo (sem silano) e conecte uma agulha de 25 G.
   8. Aspire o tratamento superficial para fora do dispositivo através das entradas e saída. Insira a tubulação Tygon na entrada aquosa, insira a seringa com óleo na tubulação PEEK e lave cada dispositivo com óleo. Aspire o óleo do dispositivo.
   9. Repita a descarga de óleo 2x a mais. Remova a tubulação Tygon.
      NOTA: O dispositivo está pronto para ser usado.

Figura 3: Dispositivo PDMS microfluido. (A) Desenho assistido por computador (AutoCAD) do design do dispositivo microfluido. A formação de gotículas de microgel ocorre nos canais de ambos os lados do canal de óleo, como visto no afloramento ampliado. (B) Visão geral da fabricação do dispositivo PDMS. Abreviação: PDMS = polidimtilsiloxano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Geração microfluídica de microgésis

1. Predetermine as concentrações desejadas de polímeros, crosslinker e outros componentes precursores de gel (ou seja, peptídeos, glicóglicanos). Dissolva o PEG-MAL, RGD e MethMAL (PEG-backbone) em PBS 10x (pH 1.5) e o crosslinker MMP-2 juntamente com 5 μM de biotin-maleimida em 1x PBS (pH 7.4).
   NOTA: Neste protocolo, a solução precursora de gel é uma formulação publicada³ composta por 45,88 mg/mL PEG-MAL de 4 braços (10 kDa), 0,82 mg/mL RGD, 8,06 mg/mL MethMAL e 4,62 mg/mL MMP-2 crosslinker (crosslinker enzimaticamente degradante). Os métodos descritos abaixo produzirão ~3 mL de microgésis.
2. Prepare 6 mL de solução surfactante diluindo o estoque de 5% FluoroSurfactante para pelo menos 1% no óleo novec. Adicione esta solução a uma seringa de 10 mL.
   NOTA: O surfactante fluorado é imiscível com água, o que permite que ele seja facilmente removido durante a transição do gel para a fase aquosa durante as lavagens pbs na etapa de purificação.
3. Corte três pedaços de tubos Tygon que são um comprimento apropriado para a altura da bomba de seringa.
4. Corte dois pedaços de tubo PEEK, ~1 polegada de comprimento. Insira um par de milímetros da tubulação PEEK na extremidade de dois pedaços de tubos de Tygon, como mostrado na Figura 4A, para ajudar a evitar que a agulha punca as entradas de tubos de Tygon.
5. Insira a extremidade não-PEEK da tubulação Tygon nas entradas dos dispositivos microfluidos. Insira a peça restante da tubulação Tygon (sem tubo PEEK na extremidade) na saída do dispositivo microfluido, como mostrado na Figura 4C.
6. Adicione pelo menos 3 mL de óleo a uma seringa de plástico de 5 mL e fixe-a a uma agulha de 25 G. Insira cuidadosamente a agulha na tubulação PEEK em uma das entradas tygon. Lave suavemente a tubulação e o dispositivo com óleo. Recolhe o óleo da tomada em um tubo cônico. Repita a descarga de óleo na outra entrada Tygon.
7. Coloque as bombas de seringa nas taxas de fluxo desejadas.
   NOTA: Este protocolo utiliza 3 mL/h para a vazão aquosa e 6 mL/h para a vazão do óleo. Pode ser necessário usar duas bombas de seringa separadas.
8. Conecte a seringa contendo o surfactante à entrada de óleo através de uma agulha de 25 G (consulte a Figura 4A) e distribua suavemente óleo suficiente para preparar a tubulação e o canal de óleo do dispositivo microfluido.
9. Uma vez configuradas as entradas do dispositivo e do óleo, adicione 0,5 mL de óleo a uma nova seringa de 5 mL, que conterá o precursor do gel. O objetivo desta pequena quantidade de óleo é ajudar a lavar a solução precursora através do dispositivo microfísico no final da corrida.
10. Em um tubo cônico, combine 1,5 mL da solução peg-backbone e 1,5 mL da solução crosslinker. Vórtice para 30 s e transfira rapidamente a solução precursora de gel combinado para a seringa de 5 mL.
11. Conecte a seringa com a solução precursora do gel à entrada aquosa através de uma agulha de 25 G. Dispense suavemente solução suficiente para preparar a tubulação e o canal aquoso.
12. Fixar as seringas nas respectivas bombas de seringa e pressionar a execução (consulte a Figura 4B). Certifique-se de que há líquido fluindo pelos canais aquosos e de óleo.
    NOTA: Recomenda-se usar um microscópio para visualizar a formação de microgel dentro do dispositivo PDMS.
13. Procure partículas de tamanho uniforme dos canais (consulte a Figura 4D). Colete os microgéis da tomada em um tubo cônico.

Figura 4: Configuração microfluida. (A) Representação do método de conexão de tubos PEEK (superior) e tubos Tygon a uma agulha de 25 G em uma seringa (inferior). (B) Configuração microfluidica com bombas de seringa, tubulação, dispositivo e microscópio. (C) Imagem de configuração do dispositivo microfluido, com duas entradas (aquosas e óleo) e uma tomada. (D) Esquema do dispositivo microfluido e imagem de campo brilhante representativa da formação esperada de microgel dos canais em um dispositivo de emulsificação de etapas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Purificação e esterilização de microgésis

1. Uma vez que a gelação esteja completa (determinada como tempo para armazenar o módulo platô na caracterização da cinética de gírtica de gelação), use uma pipeta para remover cuidadosamente a fase de óleo da parte inferior do tubo (consulte a Figura 5). Deposite isso em um recipiente de resíduos apropriado para resíduos fluorados.
   NOTA: O tempo de gelação pode ser acelerado adicionando uma base solúvel orgânica ao tubo de coleta (por exemplo, trietilamina), mas é importante notar que a adição de uma base forte pode hidrolisar quaisquer malemídeos não redigidos. Se desejar funcionalizar microgels através do excesso de maleimídeos pós-gelação, pule a adição de trietilamina.
2. Adicione mais óleo no tubo de coleta de microgel em uma proporção de 1:1. Misture invertendo suavemente o tubo de coleta. Não vórtice.
3. Deixe o tubo de coleta se contentar com ~5 min para permitir que as fases se separem. Procure a fase do óleo na parte inferior e a fase aquosa (os microgels) na parte superior (consulte a Figura 5).
4. Repita as lavagens de óleo pelo menos 2x a mais.
5. Adicione mais óleo em uma relação 1:1 com o gel e adicione 1x PBS em uma relação PBS 4:1 para gel. Inverta para misturar várias vezes. Para separar as camadas, centrifugar o tubo a ~2.000 x g por ~30 s. Procure a fase de óleo na parte inferior do tubo, gel no meio e PBS na parte superior (consulte a Figura 5).
6. Remova a fase do óleo com uma pipeta e descarte em um recipiente de resíduos.
   NOTA: Não remova o PBS. Use um tubo cônico maior para continuar as lavagens se o tubo de coleta original fosse de 15 mL.
7. Repita o óleo e o PBS lave 2x a mais. Procure o gel para transição de opaco para claro pela lavagem final, como mostrado na Figura 5, indicando que o surfactante foi removido e o gel está na fase PBS.
8. Remova todo o óleo. Não remova o PBS do tubo cônico.
9. Em uma capa de fumaça química, use uma pipeta de vidro para adicionar hexanos ao tubo em um volume igual ao PBS. Vórtice o tubo cônico para 30 s ou até misturar completamente. Centrifugar a 4.696 x g por 5 min.
10. Após a separação, procure hexanes na camada superior, PBS no meio e gel na parte inferior (consulte a Figura 5). Remova a camada de hexano e descarte-a em um recipiente para resíduos orgânicos. Aspire a PBS.
11. Repetir hexano e PBS lava pelo menos 2x a mais ou até que o gel pareça quase translúcido (consulte a Figura 5). Lave o gel com PBS 1x mais para que todos os hexanos restantes sejam removidos. Centrifugar a 4.696 x g por 5 min. Aspire a camada PBS. Tome cuidado para não perturbar a pelota de gel.
    1. Para tampar, ou saciar, qualquer maleimídeo não redigido nos microgelos, preparar uma solução de 100 mM de N-acetil-L-cisteína em 1x PBS e adicionar esta solução ao gel. Coloque em um rotador de tubo a 37 °C durante a noite, seguido por muitas lavagens com PBS para remover n-acetil-L-cisteína não redigida.
    2. Para armazenamento de longo prazo (até 1 ano), resuspenque os microgels em 70% IPA e armazene a 4 °C para ajudar a prevenir o crescimento de bactérias nos microgels.
    3. Para esterilizar os microgésis, adicione 70% de IPA ao gel em uma proporção de 4:1 v/v em uma capa de biossegurança. Vórtice do tubo para 30 s, em seguida, centrífuga a 4.696 × g por 5 min. Aspire o supernatante IPA da pelota de gel em um capuz de biossegurança. Realize 2x mais lavagens de IPA seguidas de lavagens 3x com PBS 1x estéril.
       NOTA: Todo o IPA deve ser removido antes de usar o gel com células ou animais.

Figura 5: Visão geral do procedimento de purificação do microgel. Abreviaturas: PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; IPA = álcool isopropílico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Caracterização do tamanho do microgel

NOTA: Recomenda-se permitir que partículas de microgel se equilibrem em 1x PBS durante a noite a 37 °C para inchar até o diâmetro final antes do dimensionamento.

1. Partículas de gel de imagem.
   1. Gire o gel MAP a 4.696 × g por 5 min e aspire o supernaste.
   2. Utilizando uma pipeta de deslocamento positiva, remova 5 μL de microgel da pelota de gel e dilua em 1 mL de PBS em um tubo de microcentrifuge (diluição de 1:200). Ajuste esta diluição conforme necessário.
      NOTA: Durante a formulação da solução precursora do gel, 5 μM de biotin-maleimida podem ser adicionados e usados como alternativa à rotulagem de microgéis com fluorophore. Neste caso, um streptavidin-fluorforhore pode ser adicionado a uma diluição de 1:300 (a partir de 1 mg/mL de estoque). Permita a incubação com streptavidin por pelo menos 15 minutos antes da imagem.
   3. Usando uma pipeta de deslocamento positiva, transfira 100 μL dos microgéis diluídos para os poços de uma placa clara de 96 poços.
   4. Use um microscópio widefield ou confocal para visualizar os microgésis com um objetivo de 10x. Adquira imagens dos microgéis para análise.
   5. Consulte a Figura 6 para obter imagens confocal representativas de microgésis.
2. Dimensionamento de partículas com ImageJ
   1. Abra os arquivos de imagem do microscópio no ImageJ.
   2. Selecione Analisar | Defina escala e defina a escala de imagem de acordo com o objetivo do microscópio.
   3. Selecione | de imagem Tipo | 8 bits.
   4. Selecione | de imagem Ajuste | Limite e selecione a opção "Otsu" de limiar automático da caixa suspensa.
   5. Clique em Analisar | Defina medidas e selecione o diâmetro de Feret e limite para limiar.
   6. Clique em Analisar | Analise partículas e entre na faixa de tamanho da área (em pixel^2) esperada para os microgel (para excluir pequenos detritos de serem analisados). Alterar a circularidade para 0.75-1.00 e selecione Mostrar | Contornos. Verifique os resultados do visor e exclua em bordas.
      NOTA: O filtro de forma de circularidade exclui microgéis na borda da imagem que podem produzir uma medição de diâmetro imprecisa.
   7. Execute o módulo Analisar partículas .
   8. Aguarde a saída, que é o diâmetro do Feret de cada partícula, e exporte esses resultados para uma planilha.
   9. Neste protocolo, calcule o índice de polidispersidade (IDP) para determinar a heterogeneidade no tamanho do microgel. Analisar pelo menos 100 microgéis para definir uma população: uma faixa de PDI de 1,00-1,05 define uma população monodisperse, e um PDI maior que 1,05 define uma população polidisperse. Use equação (2), equação (3) e equação (4) para calcular o PDI, conforme descrito abaixo.
      (2)
      (3)
      (4)

Figura 6: Imagens representativas de microgels. (A) Imagem confocal fluorescente da população de microgel A, (B) imagem de microgésis limiares e (C) contornos de partículas após análise do ImageJ. (D) Imagem confocal fluorescente da população de microgel B e (E) imagem de luz transmitida de microgels (microgels são quase translúcidas). (F) Representação dos resultados representativos da análise ImageJ descrita neste protocolo. Ambas as populações de microgel têm PDIs relativamente monodisperse. Ambas as populações de microgésis foram sintetizadas com uma vazão aquosa de 3 mL/h e uma vazão de óleo de 6 mL/h. No entanto, a diferença no tamanho do microgel deve-se a diferenças no tamanho do passo do dispositivo microfluido. Por exemplo, a população de microgel A foi sintetizada com um dispositivo microfluido com um tamanho de etapa de canal de 11 μm, e a população de microgel B foi sintetizada em um dispositivo com um tamanho de passo de 40 μm. Barras de escala = 100 μm. Abreviação: PDI = índice de polidispersidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Partícula desobedimento microporoso (MAP) de ressarcer andaime

1. Crie uma solução de estoque de fenil de lítio de 2 mM-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) em 1x PBS (pH 7.4).
2. Diluir a solução de estoque LAP para 0,2 mM em um volume de 1x PBS equivalente ao volume do gel. Se usar o fotoinitiador LAP para estudos de células ou estudos em animais, certifique-se de esterilizar a solução antes do uso.
3. Gire o gel MAP a 4.696 × g por 5 min e aspire o supernaste.
4. Usando uma pipeta de deslocamento positiva, transfira o volume desejado de gel para um tubo de microcentrifuuagem.
5. Adicione 0,2 mM LAP ao gel em uma relação volumosa de 1:1 (a concentração final de LAP é de 0,1 mM).
6. Vórtice a mistura e incubar por pelo menos 15 minutos no escuro.
7. Centrifugar a mistura a 18.000 × g por 5 min para pelotar o gel.
8. Remova cuidadosamente o sobrenante da pelota de gel.
9. Transfira o gel MAP para o local alvo com uma pipeta de deslocamento positiva.
10. Aplique luz focada (365 nm, 8,66mW/cm²) na amostra por 113 s para ressar o andaime.
    NOTA: O tempo de ressarcialização de 113 s foi otimizado como publicado anteriormente para concentração de LAP de 0,1 mM¹⁴, mas pode ser necessária otimização adicional para diferentes concentrações fotoiniciais.

Figura 7: Ressarcimento de andaimes MAP. (A) Esquema de remato de andaime MAP. Quando expostos a um fotoiniciador e à luz, os grupos funcionais de metanfetamina no macromer MethMAL sofrem uma reação de fotopolimerização de cliques, que une as superfícies dos microgel. (B) Representação de uma renderização 3D (Imaris) de uma imagem de microscópio de dois fótons de microgésis MAP (verde) enroscotados em forma de disco 3D, com dextran (vermelho) nos poros. (C) Representação de uma renderização 3D (Imaris) de uma imagem de microscópio de dois fótons mostrando a porosidade de um andaime MAP que foi perfundido com dextran fluorescente de 70 kDa (vermelho). Barras de escala = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Abreviaturas: MAP = partícula de bálsamo de ivado micropondos; MethMAL = macromer de ressarcimento personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

O objetivo deste protocolo é delinear todas as etapas necessárias para sintetizar blocos de construção de microgel a serem usados em um andaime MAP. O macromer de relagem MethMAL é altamente seletivo e eficiente e é compatível com múltiplas espinhas polímeras¹⁴. É importante que pelo menos 67%-75% do PEG-maleimide de 20 kDa seja modificado com grupos funcionais de methacrilamida para garantir uma alta eficiência de ressarcer. A modificação percentual pode ser mais facilmente determinada analisando ^picosde espectro de 1 H-NMR, como mostrado na Figura 1. A cinética de gelação, determinada por um viscometro, é uma métrica importante a considerar para cada formulação de gel. Este protocolo usa uma solução precursora de gel que consiste em uma espinha dorsal PEG com um grupo MAL, que reage eficientemente com crosslinkers funcionalizados por thiol para gelação de microgel. No entanto, muitas químicas de hidrogel podem ser usadas para fabricar microgels através do método microfluido de alto rendimento descrito aqui. O tempo para o início da gelação fornecerá uma visão da duração da geração de microgel microfluido. Recomenda-se escolher um pH precursor de gel que possa iniciar a gelação entre 30 min (Figura 2) e 2 h.

Se o tempo de gelação for muito rápido, a solução precursora do gel começará a polimerizar dentro do dispositivo microfluido e entupir os canais. Além disso, é importante notar que a mudança das concentrações de ligantes thiolated (por exemplo, RGD) pode ter impactos na formação da rede durante a gelação e pode precisar ser contabilizada ajustando a formulação. As etapas de fabricação do dispositivo microfluido podem ser tediosas, mas os resultados representativos de um dispositivo ligado com sucesso são mostrados na Figura 3. Este protocolo utiliza um dispositivo microfluido de alta produtividade, paralelo, emulsificação de passos que foi adaptado a partir de um projeto de de Rutte et ^al.13, e a fabricação de wafer de silício foi terceirizada para uma empresa de tecnologia microfluidic. No entanto, as etapas descritas neste protocolo podem ser usadas com qualquer design de dispositivo gravado em uma fotomask de wafer de silício SU-8. É importante notar que o tamanho da etapa dos canais na máscara fotográfica deve ser otimizado durante a fabricação do dispositivo, pois impactará o tamanho das partículas de microgel.

As taxas de fluxo para a geração microfluida de microgels devem ser otimizadas para cada formulação de gel com base em fatores como tempo de gelação, tamanho de partícula desejada e design de dispositivo microfluido. Se usar o dispositivo de alto rendimento, as taxas de fluxo para a fase aquosa podem chegar a 5 mL/h. A Figura 4B mostra a configuração para dispositivos de alto rendimento usados neste protocolo. Se o dispositivo estiver funcionando corretamente, a formação de microgel deve ser semelhante à mostrada na Figura 4D. Antes da purificação, os microgels serão opacos. Depois de completar as várias lavagens de óleo, PBS e hexano, o gel deve parecer claro como a imagem representativa na Figura 5. Se incorporar um fluoróforo nos microgelos, o produto purificado pode ter uma leve tonalidade colorida, mas ainda deve estar perto da translúcida. Após a purificação e inchaço, os microgel devem ser muito uniformes de tamanho e ter um PDI entre 1,00 e 1,05, como mostrado na Figura 6. Vários fotoiniciais podem ser usados para fotoannealing andaimes MAP. Se usar uma alternativa ao LAP, descrita aqui, deve-se determinar a cinética de ressaramento como descrito anteriormente¹⁴. Além disso, várias fontes de luz podem ser usadas para fotoannealing, desde que a fonte de luz corresponda ao fotoinitiador. Deve-se ter certeza de calibrar e concentrar a fonte de luz. O tempo de ressaramento e a intensidade da luz podem precisar ser otimizados com base na formulação de gel e concentração de fotoiniciador. O método de ressaramento descrito neste protocolo pode ser utilizado para estudos in vitro e in vivo. Após a ressaração, os microgel formarão um andaime poroso que pode ser visualizado com microscopia de dois fótons (Figura 7B-C).

Discussão

Este protocolo descreve métodos para sintetizar e caracterizar microgéis, que servem como blocos de construção para andaimes de partículas recadas microporos (MAP). Este protocolo utiliza uma abordagem microfluidica de alto rendimento para gerar grandes volumes de microgéis uniformes, que não podem ser alcançados com outros métodos como microfluidos com foco de fluxo 1,4,7,9 (alta monodisperiência, baixo rendimento), emulsão em lote ^6,10 e eletros rezando ^5,12 (baixa monodispersidade, alto rendimento). Com os métodos descritos aqui, microgel monodisperse podem ser feitos para uso em andaimes MAP que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicina regenerativa (por exemplo, parto celular, cicatrização de feridas).

Um passo crítico deste protocolo é a criação dos dispositivos microfluidos PDMS. Se os dispositivos não forem feitos corretamente, isso pode ter efeitos negativos a jusante na formação de microgel e na monodispersidade. É importante evitar a introdução de artefatos (ou seja, bolhas, poeira) no PDMS antes de curar, uma vez que isso poderia entupir os canais e impactar significativamente a formação de microgel. Para atenuar isso o máximo possível, deve-se usar fita para remover qualquer poeira, armazenar os dispositivos em um recipiente sem poeira e trabalhar em um capô sem poeira, se possível. Também é recomendado armazenar os dispositivos a 60 °C para obter os melhores resultados com o tratamento superficial.

Ao derramar os dispositivos PDMS, é importante manter uma espessura uniforme que seja quase igual ou inferior ao comprimento do soco da biópsia. Se o dispositivo for muito grosso, o soco da biópsia será incapaz de penetrar todo o caminho. Também é crucial não rasgar as entradas/saída do dispositivo PDMS enquanto perfura com o soco da biópsia e/ou inserção de tubos. Uma ruptura no dispositivo PDMS causará vazamento das entradas/saída, o que pode causar a perda da solução precursora do gel. Se houver vazamento em um dispositivo PDMS, a melhor solução é substituí-lo por um novo dispositivo o mais rápido possível.

Ao tratar o dispositivo por plasma, o uso de oxigênio puro e tratamento de plasma para 30 s produziu os melhores resultados para aderir PDMS ao escorregador de vidro. Se o dispositivo não se ligar corretamente (ou seja, o PDMS ainda pode ser levantado da lâmina de vidro após o tratamento de plasma), deve-se verificar duas vezes se o tratador de plasma está funcionando corretamente e que o dispositivo e os slides foram completamente limpos. Também é importante usar o tratamento correto da superfície de silano e, para melhores resultados, os dispositivos PDMS devem ser tratados diretamente pela superfície antes do uso. Outros métodos de tratamento superficial, como a deposição de vapor químico, também poderiam ser utilizados.

Outro passo crucial é usar os dispositivos microfluidos PDMS corretamente para a formação de microgel. Recomenda-se o uso de uma relação de fluxo de pelo menos 2:1 (este protocolo usa uma taxa de fluxo de óleo de 6 mL/h e uma taxa de fluxo aquoso de 3 mL/h), mas isso pode ser ajustado para alcançar o tamanho desejado do microgel. O pH da solução precursora do microgel também é uma métrica importante para otimizar para evitar entupimento do dispositivo. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) acelera a formação de tioolato na química de adição do tipo Michael, e as concentrações de PBS utilizadas neste protocolo produzem os melhores resultados para a gelação de microgel nos dispositivos microfluidos. Uma vez iniciadas as bombas de seringa, pode haver algumas bolhas nos canais microfluidos, mas isso deve se equilibrar após alguns minutos. Recomenda-se monitorar a formação de microgel com um microscópio. Se o fluxo não se parece como neste vídeo e/ou há alguns canais produzindo partículas grandes, isso provavelmente se deve a problemas com a etapa de tratamento da superfície. A melhor solução é substituir o dispositivo por um que tenha sido recentemente tratado pela superfície.

Se os microgel parecem estar se fundindo, isso pode ser devido a uma concentração insuficiente de FluoroSurfactant. A solução recomendada é aumentar o wt% do surfactante na fase do óleo. No entanto, uma limitação ao uso de altas concentrações de surfactante é que pode ser mais difícil de remover durante a etapa de purificação. Recomenda-se o uso de dispositivos microfluidos apenas uma vez, mas os dispositivos podem ser reutilizados se lavados com óleo Novec imediatamente após o uso para remover qualquer solução aquosa que possa gelar no dispositivo e entupir os canais. Enquanto um dispositivo microfluido pode produzir um volume de alta produtividade de microgels (mL/h), essa taxa de produção pode ser dimensionada usando vários dispositivos microfluidos em paralelo.

A etapa de ressaramento do conjunto de andaimes MAP baseia-se no uso de um fotoin iniciador ativado pela luz de polimerização radical, e o fotoinitiador pode ser selecionado com base na aplicação desejada. Por exemplo, o fotoinitiador LAP tem tempos de ressaríndia rápidos (<30 s) ao usar luz UV de ondas longas, que tem impacto mínimo na viabilidade celular in vitro¹⁴. No entanto, esse comprimento de onda é altamente absorvido pelo tecido¹⁶ e pode não ter uma eficácia de ressaramento in vivo como in vitro.

Eosin Y é outro fotoinitiador ativado por comprimentos de onda visíveis (505 nm) e tem penetração mais profunda no tecido, o que aumenta a capacidade do andaime MAP a ser revido sob o tecido. No entanto, os longos tempos de exposição à luz necessários para o ressarem eosin y podem prolongar a exposição celular a radicais livres e impactar a viabilidade celular in vitro¹⁴. O uso desses métodos para a geração de alta produtividade de blocos de construção de microgel altamente uniformes acelerará a pesquisa focada em andaimes MAP e avançará o conhecimento no campo de materiais porosos injetáveis para medicina regenerativa.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-aminoethanethiol hydrochloride	Acros Organics	AC153770250	For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da
35 mm plate rotor	HAAKE	P35/Ti	Geometry for HAAKE viscometer
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa)	NOF AMERICA Corporation	SUNBRIGHT PTE-100MA	For microgel precursor solution
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa)	NOF AMERICA Corporation	SUNBRIGHT PTE-200MA	For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch
BD Syringe with Luer-Lok Tips	Becton Dickinson		Disposable plastic syringes
Biopsy punch	Mitex	MLTX33-31A-P/25	1.5 mm diameter
Chloroform-d	Acros Organics	AC209561000	For MethMal Synthesis
Collimated LED Light Source	ThorLabs	M365LP1-C1	365 nm
Culture dish (15 cm)	Corning	CLS430599	150 mm x 25 mm
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride)	Oakwood Chemical	151882	For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da
Fluorosurfactant	Ran Technologies	008-Flurosurfactant-5wtH-200G	5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500
FreeZone Triad Freeze Dry System	Labconco	7400000 Series	For MethMal Synthesis Lyophilizer
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Plain glass slides, uncoated
HAAKE Rheowin viscometer	HAAKE
ImageJ			version 1.8.0_172
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump	Kd Scientific
LED Driver	ThorLabs	DC2200
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889	Photoinitiator
Methacrylic Acid	Sigma Aldrich	155721	For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL
Microfluidic device SU8-Si master wafer	FlowJem	N/A	Custom-made, with silanization
MMP-2 degradable crosslinker	FlowJem		Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2
Needles (25 G, beveled)	BD	305122	Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm
Novec 7500	3M	7100025016	Fluorinated oil
Oxygen	Praxair	UN1072	Compressed
Peek tubing	Trajan Scientific	03-350-523	1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)	Sigma-Aldrich	448931	For surface treatment
Phosphate Buffered Saline	Fisher BioReagants	BP3994	Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RGD cell adhesive peptide	WatsonBio Sciences		Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2
Rheowin software	HAAKE		Software compatible with HAAKE viscometer
Scalpel blade	Bard-Parker	371210	Size: #10
Scalpel handle	Bard-Parker	371030	Size: #3
Sodium Chloride	Fisher BioReagents	BP358-1	For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW Chemical	2065622	Base and curing agent
Triethylamine	Fisher Scientific	O4884-100	For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL
Tygon tubing	Saint Gobain Performance Plastics	AAD04103	ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm
Varian Inova 500 Spectrometer	Varian		NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility