Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

Resumo

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Resumo

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de dermatite de contato alérgico (ACD) que pode ser estudado em camundongos. Este estudo tem como objetivo apresentar um método laboratorial objetivo que possa ajudar a estudar a reação do CHS em camundongos, que pode ser medido e quantificado por vários testes. Para induzir o CHS, no dia "0", os camundongos foram sensibilizados em um local previamente raspado por pintura de pele abdominal com a mistura hapten 2,4,6-trinitrcloobenzeno (TNCB) em uma mistura acetona-etanol, enquanto os ratos de controle negativo foram falsos sensibilizados com a mistura veículo sozinho-acetona-etanol. No dia "4", a espessura da orelha da linha de base foi medida com um micrômetro antes da obtenção de CHS (desafio) pintando ambas as orelhas com TNCB diluído tanto nos grupos de teste quanto de controle. Após 24h, o inchaço da orelha foi medido com um micrômetro. O CHS é um exemplo de resposta imune mediada por células T que causa inchaço no tecido inflamado, atingindo 24 h após o desafio da pele com o mesmo hapten. Aumento do edema de ouvido correlacionado com aumento do peso do ouvido, atividade mieloperoxidase (MPO), concentração pró-inflamatório de citocina nos extratos de ouvido, aumento do espessamento do edematoso no exame histológico e permeabilidade vascular do ouvido. Houve também um aumento na concentração de anticorpos IgG1 específicos do TNP na sera do grupo de teste quando comparado com os camundongos de controle. Além disso, o CHS pode ser transferido com sucesso com as células efeito CHS obtidas de doadores previamente sensibilizados com tncb. As células com efeito CHS foram administradas por via intravenosa em camundongos receptores ingênuos, que foram posteriormente desafiados com o mesmo hapten diluído. O inchaço da orelha foi medido com um micrômetro 24 h depois.

Introdução

A dermatite de contato alérgica (ACD) é uma doença inflamatória da pele comum em países industrializados causada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV resultante da exposição a produtos químicos de baixo peso molecular chamados haptens. As substâncias que causam sensibilização de contato em humanos incluem íons de metal pesado (cromo, níquel, ferro, cobalto), terebintina, fragrâncias, corantes e conservantes presentes em cosméticos (por exemplo, p-fenilediamina), algumas drogas (por exemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactam (ou seja, penicilina), produtos químicos produzidos por plantas (pentadecacatechol, substância presente na hera venenosa), bem....

Protocolo

Todos os experimentos apresentados neste artigo foram realizados de acordo com as diretrizes do 1º Comitê De Ética Local em Testes em Animais em Cracóvia. Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as recomendações locais, especialmente no que se refere ao uso de cetamina/xilazina como anestésico, utilizando ambos os lados das orelhas para aplicar a substância/hapten, cortando a orelha e coletando sangue por remoção do globo ocular. FORAM utilizados para o presente estudo os camundongos machos e fêmeas BALB/c (haplotype H-2^d), CBA/J (H-2^k) e C57BL/6 (H-2^b), com idade entre 6 e 12 semanas. Para sign....

Resultados

Para indução de CHS, os animais foram sensibilizados através da pintura da pele (abdominal) com 150 μL de 5% de TNCB ou farsa sensibilizada apenas com o veículo. No dia "4", as respostas de inchaço de ouvido de ambas as orelhas foram induzidas pela pintura de contato (desafio) com 10 μL de 0,4% de TNCB em ambos os camundongos anteriormente em contato sensibilizado com tncb (grupo de teste) e os ratos do grupo controle (falsos sensibilizados). Os dados apresentados descrevem que os camundongos sensibilizad.......

Discussão

O CHS é induzido através de haptens, que se ligam a antígenos auto-proteína na pele, criando neoantígenos. O CHS é mediado pelo recrutamento extravascular local de células T com efeito de antígeno circulante, o que resulta em inchaço no tecido desafiado, atingindo 24 h após a exposição da pele secundária ao mesmo hapten⁶. O inchaço do tecido é causado principalmente pela infiltração de leucócitos e deposição de fibrina dependente de leucócitos²⁴

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	65350-M	for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655101	for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	179124
Aluminum foil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z185140
Analytical balance	Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany	PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor	MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India	MTP-E-212	automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)	Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA	BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	553441
BSA (bovine serum albumine)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	A9418	protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm	BIOLOGIX, China	15-1070	suitable for 50 mL tubes
Coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-1583	24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	14190144	no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	6522	mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight	Animalab, Poznan, Poland	11251-10FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent	Animalab, Poznan, Poland	11272-50FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,086	polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,094	polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.07017
Ethanol 96%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.59010
Evans blue	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	E2129
FBS (fetal bovine serum)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT501128
Formamide 99.5% (GC)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F7503
Freezer -20 °C	Bosch, Germany	GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C	Bosch, Germany	KGV36V10	mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449	Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism	GraphPad Software Inc.	v. 9.4.0
Grey soap	Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland	Bialy jelen soap bar	grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.60313
Harris hematoxylin solution	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HHS16
Hemocytometer	VWR, Avantor, U.S.A	612-5719	manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H5882
Homogenizer	QIAGEN Hilden, Germany	Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234	homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA	SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H1009
Incubator Heracell 150i	Thermo Electron LED Gmbh, Germany	41071068	37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection	Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland	cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.05108
Laboratory Centrifuge	Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany	B00013899	speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge	Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany	75002425	speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	111-0917	for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice	Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland	CBA/J, C57BL/6
Micrometer	Mitutoyo, Tokyo, Japan	193-111	digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655061	with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives	Leica Microsystems CMS GmbH, Germany	DM1000, 294011-082007	histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S9390
Olive-oil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	75343	pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555138
Ortho-dianisine dihydrochloride	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	D3252
Paraffin wax	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	76242	beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	20012027	pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter	Elmetron, Poland	CP-401
Pipettes, variable volume with tips	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	EP3123000900-1EA	3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	PERS94-0462	scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome	MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK	HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp	Animalab, Poznan, Poland	14060-10FST	Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27056	black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer	BioTek Instruments, U.S.A	201446	universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S6141	e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm	Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA	33-36
Surgical scissors	Animalab, Poznan, Poland	52138-46	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z672122	tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)	Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan	C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)	Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA	T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	78510
Tubes 15 mL sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430055 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430290 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tween 20	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27173	for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath	AJL Electronic, Poland	LW102
Wax (paraffin) dispenser	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection	Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland	cat.# not avaliable
Xylene (histological grade)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	534056