Um dispositivo de terapia fotodinâmica interno construído internamente e baseado em diodo emissor de luz para melhorar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D

Resumo

Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.

Resumo

Este artigo descreve um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD), chamado PhotoACT. O dispositivo foi construído usando um conjunto de diodos emissores de luz programáveis convencionais (LEDs), um módulo de display de cristal líquido (LCD) e um sensor de luz conectado a uma placa microcontroladora comercial. A estrutura baseada em caixa do protótipo foi feita com painéis de fibra de média densidade (MDFs). O compartimento interno pode alocar simultaneamente quatro microplacas multipoços de cultura celular.

Como prova de conceito, estudamos o efeito citotóxico do fotossensibilizador (PS) verteporfina contra a linhagem celular HeLa em cultura bidimensional (2D). As células HeLa foram tratadas com concentrações crescentes de verteporfina por 24 h. O meio sobrenadante contendo fármaco foi descartado, as células aderentes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o meio livre de drogas foi adicionado. Neste estudo, o efeito da verteporfina nas células foi examinado sem exposição à luz ou após exposição por 1 h à luz usando valores vermelho-verde-azul (RGB) de 255, 255 e 255 (fluência média de 49,1 ± 0,6 J/cm²). Após 24 h, a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

Os resultados experimentais mostraram que a exposição das células tratadas com verteporfina à luz do dispositivo aumenta o efeito citotóxico da droga através de um mecanismo mediado por espécies reativas de oxigênio (ROS). Além disso, o uso do protótipo descrito neste trabalho foi validado comparando-se os resultados com um dispositivo PDT comercial. Assim, este protótipo de terapia fotodinâmica à base de LED representa uma boa alternativa para estudos in vitro de TFD.

Introdução

Entre as doenças não transmissíveis mais letais, o câncer representa uma das principais causas globais de morte prematura. Foi responsável por quase 10 milhões de mortes em 2020, representando cerca de uma em cada seis mortes em todo o mundo¹. Além disso, o fenômeno da multirresistência (MDR) representa uma tremenda ameaça à saúde pública, uma vez que os protocolos quimioterápicos aprovados não atingem os estágios de remissão para essa condição clínica². As células cancerosas podem desenvolver resistência à quimioterapia através de vários mecanismos; no entanto, a superexpressão de alguns transportadores de de ligação a ATP (ABC) - bombas de efluxo dependentes de ATP - é considerada a principal causa do desenvolvimento de MDR dentro de um microambiente tumoral³. Além da MDR, outras complicações do câncer, como recidiva e metástase, reforçam a demanda urgente de desenvolver e aprimorar abordagens terapêuticas para superar esse desafio oncológico.

A utilização curativa da luz tem sido praticada há séculos⁴, e a terapia fotodinâmica (TFD) representa uma abordagem terapêutica clinicamente aprovada para tumores sólidos. A TFD combina a administração de um fotossensibilizador (PS) seguido de irradiação de luz para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) para exercer citotoxicidade seletiva em células tumorais. Essa abordagem terapêutica é superior aos métodos convencionais, incluindo cirurgia, radiação e quimioterapia⁵; é uma técnica minimamente invasiva que apresenta menor citotoxicidade nos tecidos conjuntivos⁶. A aplicação de luz e o acúmulo de PS diretamente no tumor ou em seu microambiente garantem direcionamento preciso e, consequentemente, efeitos colaterais sistêmicos menores e indesejáveis⁷ e a possibilidade de tratamento repetido no mesmo local. Além disso, o custo é menor do que o de outras abordagens. Devido às suas características promissoras, a TFD pode ser considerada uma opção adequada tanto para a doença isolada, principalmente no caso de tumores inoperáveis, quanto para o tratamento adjuvante do^câncer7, e representa uma alternativa para a MDR relacionada à quimioterapia ^8,9.

O primeiro relato mostrando uma alta taxa de resposta objetiva usando PDT foi descrito em 1975 em um rato e rato modelo¹⁰. Desde então, estudos têm sido realizados utilizando TFD com desfechos positivos⁷ in vivo e in vitro com linhagens celulares tumorais humanas em cultura de células 2D^11,12. Considerando a ampla aplicabilidade do PS clinicamente aprovado, independentemente de suas vias de acumulação específicas e faixas de comprimento de onda dos picos de absorção, o processo geral é o seguinte: (i) captação de PS, (ii) pico de concentração de PS no tumor ou em seu microambiente, (iii) aplicação de luz, (iv) interação PS-luz, (v) transferência de energia de estado excitada de PS para o substrato tecidual ou moléculas de oxigênio circundantes, (vi) produção de ERO envolvendo oxigênio singlete ou ânion superóxido, (vii) morte de células tumorais via, essencialmente, necrose ou apoptose (morte direta), autofagia (mecanismo citoprotetor), isquemia tecidual (dano vascular), modulação imunológica ou sobreposição desses mecanismos⁷. Nessa etapa final, a ativação de uma via específica de morte celular depende de muitos fatores, como características celulares, delineamento experimental e, mais importante, localização intracelular da PS e dano direcionado relacionado à TFD¹³.

A verteporfina é um PS de segunda geração, aprovado por agências reguladoras para uso clínico na Noruega e na China para tratar a degeneração macular relacionada à idade⁷. Após a administração da dose, foi relatado que esse pró-fármaco se acumula parcialmente nas mitocôndrias¹⁴ e induz fosforilação da proteína tirosina celular e fragmentação do DNA, levando à apoptose das células tumorais^15,16. Após 24 h de incubação para internalização da verteporfina, recomenda-se um protocolo PDT utilizando uma configuração de comprimento de onda de 690 nm para atingir níveis efetivos de transferência de radiação eletromagnética para moléculas adjacentes ^7,17.

Em relação à fonte de luz para TFD, os sistemas clássicos de laser de diodo geralmente são caros, tecnicamente complicados, superdimensionados e, portanto, não portáteis^18,19. Como consequência de seu perfil de comprimento de onda único, que também pode ser observado em equipamentos PDT baseados em LED, a demanda por unidades independentes para cada aplicação de fotossensibilizador torna a utilização de sistemas de laser de diodo ainda mais complexa e economicamente inviável^20,21. Portanto, a utilização de máquinas de LED é considerada a alternativa mais promissora para resolver não apenas os custos²² e problemas de manutenção, mas também para proporcionar alta potência de saída e menos prejudicial 23 e maior capacidade de iluminação 24,25,26,27.

Apesar da contribuição potencial que os equipamentos baseados em LED podem oferecer para os experimentos de TFD²⁸, a maioria das opções comerciais ainda possui desvantagens, como falta de portabilidade, alto custo e projetos e operações de construção e operação complexos²⁹. O principal objetivo deste trabalho foi oferecer uma ferramenta simples e confiável para ensaios de TFD in vitro . Este artigo descreve o PhotoACT, um dispositivo PDT baseado em LED construído internamente, que é barato, fácil de usar e portátil. Como prova de conceito, este dispositivo é mostrado para aumentar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D e, portanto, pode ser usado como uma ferramenta de pesquisa em experimentos de PDT.

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Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e software usados neste protocolo.

1. Construção do dispositivo

1. Serra de 3 mm de espessura de painéis de fibra de média densidade (MDF) para obtenção de peças com as dimensões mostradas na Figura 1A.
   Observação : use o arquivo vetorial (arquivo suplementar 1) para o corte de controle numérico computadorizado (CNC).
2. Construa duas caixas com as seguintes dimensões (comprimento x largura x altura): 330 mm x 235 mm x 225 mm para as caixas maiores e 300 mm x 220 mm x 150 m para as caixas menores (Figura 1B).
3. Perfure a parte de trás da caixa maior para instalar um conector de tomada de barril. Perfure a parte superior da caixa maior e coloque a parte superior e inferior da caixa menor para fornecer uma passagem para cabos elétricos (Figura 1C).
4. Pintar todas as superfícies internas com tinta preta para promover uma incidência de luz homogênea (Figura 1D).
5. Anexe, em paralelo, três fitas de LED com 10 LEDs cada na superfície interna superior da caixa menor (Figura 1E).
6. Instale um sensor de brilho no centro da superfície interna inferior da caixa menor (Figura 1F).
7. Imprima a estrutura da unidade de controle (Figura 1G) usando o arquivo de impressão 3D (Arquivo Suplementar 2).
8. Instale todos os componentes (botão liga/desliga, potenciômetros, touchpad de tempo/partida, LEDs, sensor de brilho, LCD, campainha e fonte de alimentação) nas portas de uma placa de controle ESP32 montada no interior da unidade de controle (Figura 2).
9. Carregue o código de programação (Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5) e execute um teste para verificar se todas as conexões estão funcionando (Figura 1H).
10. Monte as caixas e fixe-as juntas para evitar lacunas e, consequentemente, interferência de luz externa e perda de luz emitida. Conecte a unidade de controle montada à área perfurada na parte superior do protótipo (Figura 1I).
11. Fixe uma porta da frente do mesmo material e dimensões de 330 mm x 225 mm (comprimento x largura) na caixa maior com duas dobradiças pequenas. Além disso, prenda fitas de velcro lateralmente à caixa maior para reforçar o fechamento do protótipo (Figura 1J). Instale uma maçaneta para manipular a porta da frente do equipamento.
12. Fixe quatro almofadas de borracha na parte inferior do protótipo para garantir mais estabilidade durante as operações (Figura 1K).

2. Linhagens celulares: cultivo, semeadura e tratamento

1. Produtos químicos
   1. Dissolva a porfirina em dimetilsulfóxido (DMSO) para atingir uma concentração de 100 mM.
      CUIDADO: O DMSO deve ser manipulado com cuidado (manuseio com o uso de equipamentos de proteção individual e em área ventilada). Manipule cuidadosamente as unidades populacionais e as soluções diluídas para evitar uma exposição excessiva à luz.
2. Linhagens celulares
   1. Cultivar a linhagem celular HeLa em meio de baixa glicose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de gentamicina.
   2. Manter os frascos de cultura numa incubadora de cultura de células de CO₂ a 5% a 37 °C.
   3. Gerencie e inspecione as células até que elas atinjam 80% a 90% de confluência.
3. Processo de semeadura
   1. Retirar o meio de cultura do balão.
   2. Lave a monocamada celular com PBS.
   3. Retirar a cultura de células confluentes com tripsina-EDTA (0,5%) 1x por 5 min a 37 °C. Interromper a ação da tripsina ressuspendendo as células com meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de gentamicina.
   4. Conte as células ressuspensas com um hemocitômetro e semeie-as em uma placa de 96 poços a 2,0 × 10⁴ células/poço.
   5. Prepare duas placas para condições escuras e claras.
   6. Incubar as placas por 24 h para fixação celular.
4. Processo de tratamento
   1. Remova o meio de ambas as placas de 96 poços.
   2. Tratar as células com 100 μL de concentrações crescentes de verteporfina (0,045 a 24 μM, diluição em série).
   3. Incubar as células com tratamento medicamentoso por 24 h para permitir a internalização da verteporfina.
   4. Após 24 h, descarte o meio que contém a droga, lave a monocamada de células com PBS (100 μL) e adicione o meio livre de drogas (100 μL).
   5. Cubra uma microplaca com papel alumínio para protegê-la da exposição à luz e incube-a por 24 h. Esta placa fornecerá dados de controle para os resultados de PDT (condição escura). A outra microplaca será utilizada na condição de exposição à luz no dispositivo.

3. Funcionamento do dispositivo

1. Conecte o dispositivo PDT à tomada elétrica e ligue-o pressionando o botão liga/desliga .
2. Coloque a outra microplaca (condição de luz) no dispositivo PDT e feche o equipamento prendendo a porta da frente com as fitas de velcro.
3. Use os potenciômetros para ajustar a configuração RGB (um experimento RGB 255, 255, 255 aqui) e definir a cor da emissão de luz.
   NOTA: Cada combinação RGB possui um espectro de emissão específico, que deve ser ajustado para experimentos com diferentes fotossensibilizadores e, consequentemente, diferentes curvas de absorbância.
4. Pressione o touchpad (+)/(- ) para ajustar a configuração de tempo (um experimento de 60 minutos aqui) e definir a duração do ensaio.
   NOTA: A configuração do tempo, em associação com o valor de irradiância, determinará a fluência do processo - a dose de luz aplicada no ensaio.
5. Verifique as informações de configuração no visor.
6. Pressione o botão Iniciar para iniciar o ensaio. Certifique-se de que uma campainha de um bipe seja ouvida no início do ensaio.
7. No decorrer do experimento, observe informações em tempo real no visor, como irradiância e tempo restante.
8. Não abra a porta da frente nem altere qualquer configuração durante o ensaio PDT.
9. No final do ensaio, aguarde uma campainha de quatro bipes e que o sistema eletrônico desligue todos os LEDs. Observe uma mensagem Concluído e a quantidade final de energia gasta - fluência - durante o experimento na tela.
   NOTA: O valor final da fluência é calculado utilizando a equação (1):
   (1)
   Onde F é igual a J/cm 2 e I é igual a mW/cm 2 ou mJ/s·cm ². O valor de irradiância considera a potência dos LEDs (fonte emissora) e a área uniformemente irradiada da câmara escura (660 cm 2) (equação [2]):
   (2)
   O valor teórico de irradiância é mostrado na tela do dispositivo durante todo o ensaio PDT. No final da operação, use a equação (3) para calcular a fluência:
   Fluência (F) = irradiância (I, valor constante) × tempo(s) de operação (s) (3)

4. Ensaio de viabilidade celular

1. Após o ensaio de TFD, cubra a microplaca que foi exposta à luz e incube por 24 h.
2. Após o período de incubação, retirar o meio de cultura de ambas as placas, lavar a monocamada de células com PBS (100 μL) e adicionar solução de MTT (0,5 mg/ml, 100 μL). Incubar ambas as placas - condições escuras e claras - por 4 h para permitir a formação de cristais formazan.
3. Remova cuidadosamente a solução de MTT e dissolva os cristais roxos com uma solução de DMSO/etanol (1:1).
4. Após a dissolução completa dos cristais, efectuar a medição da absorvância utilizando um leitor de microplacas a 595 nm.
   NOTA: O dispositivo pode ser utilizado em outros experimentos importantes, como a morte celular mediada por EROs desencadeada por fotossensibilizadores após exposição à luz por citometria de fluxo³⁰.

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Resultados

O dispositivo PDT final, chamado de PhotoACT, incluía uma câmara escura para alocar até quatro microplacas multipoço, com sua superfície interna superior equipada com um conjunto de 30 LEDs dispersos programados para emitir espectros distintos de luz visível (Figura 3 e Arquivo Suplementar 6). O dispositivo foi construído utilizando duas caixas associadas: uma caixa interna projetada como uma câmara escura para os ensaios de PDT e uma caixa externa para cobrir a câm...

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Discussão

O dispositivo PhotoACT final foi conveniente para construir com componentes de baixo custo disponíveis comercialmente a um custo total de menos de US $ 50. As vantagens adicionais incluem baixas demandas de manutenção, a capacidade de irradiar vários tipos de placas de cultura, o uso simultâneo de até quatro unidades por ensaio, baixo peso (2 kg)/tamanho (44 cm³) que permite portabilidade, irradiação precisa e reprodutível (dados não mostrados) e uma interface de configuração simples e fácil de us...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)