Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Resumo

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Resumo

O influxo de cálcio em resposta à estimulação do receptor de células T é uma medida comum da sinalização de células T. Vários corantes indicadores de cálcio foram desenvolvidos para avaliar a sinalização do cálcio por citometria de fluxo passa-faixa. Este protocolo é projetado para medir as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando citometria de fluxo de espectro completo. Os esplenócitos totais são marcados com o corante indicador de cálcio ratiométrico Indo-1, juntamente com um painel de anticorpos conjugados ao fluorocromo para moléculas de superfície celular. Aproveitar os recursos da citometria de fluxo de espectro completo fornece uma plataforma para utilizar uma ampla gama de colorações da superfície celular em combinação com o Indo-1. As células são então analisadas em tempo real a 37 °C antes e depois da adição de um anticorpo anti-CD3 para estimular o receptor de células T. Depois de desmisturar os sinais espectrais, a proporção de Indo-1 ligado ao cálcio e livre de cálcio é calculada e pode ser visualizada ao longo do tempo para cada população fechada de esplenócitos. Esta técnica pode permitir a análise simultânea das respostas do cálcio em múltiplas populações celulares.

Introdução

O influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T (TCR) é uma medida útil da ativação de células T e é frequentemente usado para determinar se uma população de células T tem respostas prejudicadas nas etapas proximais da via de sinalização TCR¹. As medidas do influxo de cálcio são geralmente realizadas pré-marcando as células T com um ou um par de corantes indicadores fluorescentes de cálcio e, em seguida, examinando os sinais fluorescentes usando citometria de fluxo em tempo real após a reticulação do TCR ^2,3,4. O indo-1, u....

Protocolo

Os camundongos foram mantidos no campus de Medicina da Universidade do Colorado Anschutz de acordo com os protocolos da IACUC. Todos os camundongos foram eutanasiados de acordo com os padrões da AAALAC.

1. Preparação de células imunes do baço de camundongo

NOTA: Eutanásia de camundongos ingênuos com eutanásia por CO₂ . Camundongos C57BL/6 comprados do Jackson Laboratories e criados internamente são usados para experimentos com 6-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas são utilizados para experimentos.

1. Desinfetar a pele do rato com etanol a 70% para reduzir a possibil....

Resultados

O fluxo de trabalho experimental para avaliar as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando um corante ratiométrico Indo-1 com coloração superficial multiplexadora é mostrado na Figura 1. Após a colheita e processamento dos esplenócitos de camundongos em uma única suspensão celular, as células são coradas com um éster Indo-1 AM e a superfície corada com anticorpos ligados ao fluorocromo. Uma vez concluída a carga do corante e a coloração de anticorpos, as amo.......

Discussão

Este protocolo descreve um ensaio otimizado projetado para medir as respostas de cálcio em células T primárias murinas carregadas com corante indicador ratiométrico Indo-1 titulado usando citometria de fluxo de espectro completo ^7,8. A vantagem de realizar ensaios de fluxo de cálcio usando citometria de fluxo de espectro total é a capacidade de coloração de marcadores de superfície celular multiplex em combinação com a avaliação da fluorescência do .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath