Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Resumo

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Resumo

Os organoides são um método confiável para modelar o tecido do órgão devido às suas propriedades auto-organizadas e retenção de função e arquitetura após a propagação do tecido primário ou células-tronco. Este método de geração de organoides renuncia à diferenciação unicelular através de múltiplas passagens e, em vez disso, usa centrifugação diferencial para isolar organoides epiteliais mamários de tecidos dissociados mecanicamente e enzimaticamente. Este protocolo fornece uma técnica simplificada para a produção rápida de organoides epiteliais pequenos e grandes a partir de tecido mamário humano e camundongo, além de técnicas para incorporação de organoides no colágeno e na matriz extracelular do porão. Além disso, instruções para fixação em gel e coloração imunofluorescente são fornecidas com a finalidade de visualizar a morfologia e a densidade organoides. Essas metodologias são adequadas para uma miríade de análises a jusante, como a co-cultura com células imunes e a modelagem de metástases ex vivo por meio de ensaio de invasão de colágeno. Essas análises servem para elucidar melhor o comportamento célula-célula e criar uma compreensão mais completa das interações dentro do microambiente tumoral.

Introdução

A capacidade de modelar células epiteliais in vitro tem sido a base da pesquisa biomédica moderna, porque captura características celulares que não são acessíveis in vivo. Por exemplo, o crescimento de linhagens celulares epiteliais em um plano bidimensional pode fornecer uma avaliação das mudanças moleculares que ocorrem em uma célula epitelial durante a proliferação¹. Além disso, a mensuração da regulação dinâmica entre sinalização e expressão gênica é limitada em sistemas in vivo ². Na pesquisa do câncer, a modelagem da linhagem celular epitelial do câncer permitiu a identificação de fatores moleculares da progressão da doença e potenciais alvos de drogas³. No entanto, o crescimento de linhagens celulares epiteliais cancerígenas em um plano bidimensional tem limitações, pois a maioria é geneticamente imortalizada e modificada, muitas vezes de natureza clonal, selecionada por sua capacidade de crescer em condições não fisiológicas, limitada em sua avaliação da arquitetura do tecido tumoral tridimensional (3D) e não modela adequadamente as interações microambientais dentro de um ambiente tecidual realista⁴. Essas restrições são particularmente evidentes na modelagem de metástases, que in vivo inclui vários estágios biológicos distintos, incluindo invasão, disseminação, circulação e colonização no local distante do órgão⁵.

Organoides epiteliais cancerígenos têm sido desenvolvidos para melhor recapitular o ambiente 3D e o comportamento dos tumores ^6,7,8. Os organoides foram desenvolvidos pela primeira vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ únicas e diferenciados para representar a estrutura 3D de unidades cripta-vilosas que mantiveram a estrutura hierárquica do intestino delgado in vitro⁹. Essa abordagem permitiu a visualização e caracterização em tempo real da arquitetura de tecidos auto-organizados sob condições homeostáticas e de estresse. Como uma extensão natural, os organoides epiteliais do câncer foram desenvolvidos para modelar muitos tipos diferentes de câncer, incluindo câncer colorretal 10, pancreático 11, mama 12, fígado 13, pulmão 14, cérebro 15 e câncer gástrico ¹⁶. Organoides epiteliais oncológicos têm sido explorados para caracterizar a evolução do câncer^17,18 e comportamentos espaço-temporais metastáticos^19,20 e interrogar a heterogeneidade tumoral^21, e testar quimioterapias ²². Organoides epiteliais do câncer também foram isolados e coletados durante ensaios clínicos em andamento para predizer a resposta do paciente a agentes anticancerígenos e radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Além disso, os sistemas que incorporam organoides epiteliais cancerígenos podem ser combinados com outras células não cancerígenas, como células imunes, para formar um modelo mais abrangente do microambiente tumoral para visualizar interações em tempo real, descobrir como as células epiteliais cancerígenas alteram a natureza fundamental das células imunes efetoras citotóxicas, como as células natural killer, e testar potenciais imunoterapias e atividade citotóxica dependente de anticorpos^{26, 27,28}. Este artigo demonstra um método de geração de organoides epiteliais sem passar e incorporar colágeno e matriz extracelular basal (MEC). Além disso, técnicas para imagens a jusante de organoides isolados também são compartilhadas.

Protocolo

Todo o tecido de camundongo utilizado neste manuscrito foi coletado eticamente de acordo com os regulamentos e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. Da mesma forma, todos os pacientes consentiram antes da doação de tecidos sob a supervisão de um Comitê de Revisão Institucional (IRB), e as amostras foram desidentificadas.

NOTA: Este protocolo descreve a geração de organoides a partir do tecido primário.

1. Preparação noturna de materiais

1. Para a incorporação na matriz extracelular de cave (BECM), descongelar a alíquota BECM deixando-a a 4 °C.

2. Preparação da solução de revestimento de colagenase e albumina sérica bovina (BSA)

1. Preparar solução de revestimento BSA/PBS a 2,64% (Solução BSA): Filtro estéril 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 4,10 mL de solução BSA a 30% usando um frasco filtrante de 50 mL/0,2 μm. Esta solução BSA pode ser filtrada e usada novamente.
2. Preparar solução de colagenase para tecido mamário de rato: Filtro estéril 27 ml de meio basocelular, 1,5 ml de soro fetal bovino (FBS), 30 μL de 50 mg/ml de gentamicina, 15 μL de 10 mg/ml de insulina, 600 μL de 0,1 g/ml de colagenase A e 600 μL de tripsina 0,1 g/ml utilizando um balão de filtro de 50 ml/0,2 μm. Alocar entre 10 mL e 30 mL de solução de colagenase por camundongo, dependendo da massa tecidual.
3. Preparar solução de colagenase para tecido mamário humano: Filtro estéril 18 mL de RPMI-1640, 200 μL de 100x solução de penicilina-estreptomicina (pen/estreptococo), 200 μL de 10 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico ácido (HEPES) Tampão 1 mL de FBS e 400 μL de 0,1 g/mL de colagenase A usando um frasco de filtro de 50 mL/0,2 μm. Aloque entre 10 mL e 20 mL por amostra de tecido, dependendo da massa tecidual.

3. Preparação de mídia

1. Preparar meios organoides: Meio basocelular filtrado estéril com caneta/estreptococo a 1% e Insulina-Transferrina-Selênio (ITS) a 1% usando um frasco filtrante de 50 mL/0,2 μm. Para fazer o meio do fator de crescimento organoide, adicione o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) a uma concentração final de 2,5 nM.
2. Preparar meios epiteliais mamários: Fazer 100 mL de meio epitelial mamário, filtro estéril de meio basal comum de alta glicose com 1 mL de suplemento de glutamina 100x, 1 mL de caneta/estreptococo, 1 mL de tampão HEPES de 10 mM (7,3 pH), 250 μL de estoque de 30% de BSA, 1 μL de estoque de toxina de cólera de 1 mg/mL, 1 mL de estoque de hidrocortisona de 50 μg/mL em PBS, 50 μL de 10 mg/mL de solução de insulina humana, 10 μL de 50 μg/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) e 1% de FBS usando um frasco de filtro de 150 mL/0,2 μm. Conservar o suporte a 4 °C e utilizar até 2 semanas.
3. Preparar lavagem anfotericina: Filtro estéril PBS com 2% de pen/estreptococo e 2% de anfotericina B. Armazenar a 4 °C.

4. Coleta e digestão de tecidos

1. Tecido mamário de rato
   1. Eutanasie o rato colocando em uma câmara de CO 2 por_2-5 minutos e, em seguida, siga com luxação cervical. Com o lado ventral voltado para cima, jogue os membros do rato e use quatro agulhas de 19 G para prender o rato pelas patas a uma tábua coberta com uma almofada absorvente. Pulverize com etanol a 70% para suavizar a pele e higienizar a pele. Limpe as fezes com uma gaze ou lenço de papel.
   2. Começando logo acima da região anogenital, corte para cima a partir da linha média usando tesoura cirúrgica, tomando cuidado para não perfurar o peritônio. Ao chegar ao queixo, faça cortes laterais nas clavículas e nas patas traseiras e prenda a pele do rato esticada à prancha para expor as almofadas de gordura mamária.
   3. Localize as almofadas de gordura mamária inguinal em camundongos do tipo selvagem, identificando o linfonodo inguinal localizado perto dos membros posteriores. Localize as almofadas de gordura mamária torácica em camundongos do tipo selvagem como o tecido vascularizado mais espesso sob os membros dianteiros.
   4. Use fórceps para elevar a almofada de gordura mamária. Evite coletar músculo subjacente. Usando a extremidade contundente da tesoura afiada, crie um bolso sob a almofada de gordura mamária, longe da pele. Corte a almofada de gordura mamária em uma peça completa.
   5. Uma vez que as almofadas de gordura mamária tenham sido removidas, enxágue em PBS antes de colocá-las em um prato de cultura de tecidos estéreis. Transfira rapidamente para um exaustor de cultura de tecidos.
      NOTA: Para tumores mamários, use um cotonete molhado com PBS para rolar suavemente o tumor para longe da pele. Certifique-se de evitar áreas escurecidas ou macias, pois a descoloração escura indica necrose, o que não produzirá organoides saudáveis.
   6. Pice os tumores mamários com um bisturi # 10 ou # 11 para soltar o tecido até que atinja uma consistência semelhante a uma pasta. Transfira o tecido picado para um tubo cônico contendo 10-30 mL de solução de colagenase usando um bisturi. Para garantir que todo o tecido seja coletado, pipete 1 mL de solução de colagenase para a placa de cultura de tecidos e de volta para o tubo cônico.
      NOTA: Para produzir organoides maiores, a digestão mecânica deve ser minimizada, deixando alguns pequenos pedaços visíveis de tecido intactos. Alternativamente, o tecido pode ser armazenado congelado para posterior preparação organoide com perda mínima de viabilidade. Para fazer isso, lave o tecido em uma solução de PBS ou meio basocelular + 1% FBS e, em seguida, pice grosseiramente para aumentar a área de superfície (mantendo o tecido em um ou dois pedaços sólidos). Mova o tecido para um frasco para criofrascos, no topo com meios de congelamento (90% FBS + 10% dimetilsulfóxido (DMSO)). Congele os frascos para injetáveis num recipiente de congelação de taxa controlada durante a noite antes de passar para o armazenamento em azoto líquido.
   7. Colocar o tubo cónico numa incubadora de agitação de bancada a 37 °C a 180 RPM até que o tecido se torne fibroso e a solução de colagenase fique turva. Por exemplo, uma grande massa de tecido (cerca de 500-800 mg) de um tumor leva 30-60 min. Uma massa de tecido menor (cerca de 100-300 mg) de almofadas de gordura mamária do tipo selvagem leva cerca de 20-30 min. Se não tiver certeza, verifique em intervalos de 5 minutos.
   8. Após incubação, centrifugar o tubo cônico por 10 min a 550 x g à temperatura ambiente (RT).
   9. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo cônico.
      NOTA: Avançando, pré-cubra todas as pontas da pipeta, pipetas sorológicas e tubos cônicos com solução BSA para evitar a perda de organoides devido à adesão ao plástico.
   10. Adicionar 8 mL de meio basocelular e 80 μL de solução de DNase [2 U/μL] ao tubo. Inverta suavemente por 1-3 min.
   11. Adicione 12 mL de meio basocelular ao tubo e misture cuidadosamente pipetando ou gire suavemente o tubo 15 vezes para misturar.
   12. Centrífuga por 10 min a 550 x g em RT.
   13. Aspirar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o pellet em 12 mL de meio basocelular.
   14. Deixe os fragmentos de tecido mais pesados se depositarem no fundo. Recolher o sobrenadante com uma pipeta serológica e transferir para um tubo cónico de 15 ml. Esta suspensão contém organoides epiteliais e células estromais/imunitárias.
2. Tecido mamário humano
   1. Processar as amostras de tecido mamário humano para organoides ou armazená-las dentro de 24 horas após a coleta. Armazenar as amostras a 4 °C em meio independente de CO₂ com 1% de antibiótico-antimicótico a 100x.
   2. Transfira o tecido para uma placa de cultura de tecidos. Incline a placa e aspirar o meio de armazenamento em excesso e, em seguida, enxaguar o tecido com 5 mL da lavagem com anfotericina B. Retire imediatamente a lavagem com anfotericina B.
   3. Pique a amostra de tecido com um bisturi #10 ou #11 para soltar o tecido até que ele atinja uma consistência semelhante a uma pasta. Transfira o tecido picado para um tubo cônico contendo 10-30 mL de solução de colagenase usando um bisturi. Para garantir que todo o tecido seja coletado, pipete 1 mL de solução de colagenase para a placa de cultura de tecidos e retorne ao tubo cônico.
      NOTA: Para produzir organoides maiores, a digestão mecânica deve ser minimizada, deixando alguns pequenos pedaços visíveis de tecido intactos. A massa tecidual inicial para este protocolo variou entre 100-250 mg. Alternativamente, o tecido pode ser armazenado congelado para posterior preparação organoide com perda mínima de viabilidade após a etapa 4.2.2 em 90% FBS + 10% DMSO, conforme acima.
   4. Coloque o tubo cônico em uma incubadora de agitação de bancada de 37 °C a 180 RPM até que o tecido se torne menor e a colagenase fique turva. Verifique o tecido em intervalos de 5 minutos. A dissociação da colagenase de amostras humanas leva cerca de 5-20 min.
   5. Após a incubação, girar o tubo cônico por 10 min a 550 x g no RT.
   6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo cônico.
      NOTA: Avançando, pré-revestir todas as pontas da pipeta, pipetas sorológicas e tubos cônicos com solução de BSA para evitar a perda de organoides devido à adesão ao plástico.
   7. Adicionar 4 mL de meio basocelular e 40 μL de solução de DNase [2 U/μL] ao tubo cônico. Inverta suavemente por 3 min.
   8. Adicionar 6 ml de meio basocelular ao tubo e misturar cuidadosamente por pipetagem ou girar suavemente o tubo cónico 15 vezes para misturar.
   9. Centrífuga por 10 min a 550 x g em RT.
   10. Aspirar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o pellet em 10 mL de meio basocelular.
   11. Deixe os fragmentos de tecido mais pesados se depositarem no fundo. Recolher o sobrenadante e transferi-lo para um tubo cónico de 15 ml. Esta suspensão contém organoides epiteliais e células estromais/imunitárias.

5. Centrifugação diferencial

1. Pulse a 550 x g por 3-4 s no RT, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 mL de meio basocelular. Repita este passo mais três vezes (um total de quatro voltas).
2. Após cada centrifugação, certifique-se de que o pellet se torne cada vez mais opaco. Este pellet restante será organoides epiteliais.

6. Coleta de pequenos organoides

1. Pulse para 80-100 x g por 3 s em RT. Colete o sobrenadante em um tubo fresco revestido de BSA e, em seguida, pulse para 550 x g por 3 s em RT para pellet os pequenos organoides.

7. Incorporação de organoides no BECM

1. Alicotar a suspensão adequada de organoides em tubos microcentrífugos de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de BECM por poço (Tabela 1). Por exemplo, use 50-100 organoides para 20 μL de BECM em um poço de uma placa de 96 poços.
   NOTA: A densidade organoide pode ser contada utilizando a seguinte fórmula: ((Número médio de organoides)/50 μL) x factor de diluição.
2. Execute todas as etapas no gelo. Coloque o BECM descongelado no gelo em um capuz de cultura de tecidos. Ao preparar o capô, coloque todas as pontas da pipeta no gelo para esfriar.
3. Centrifugar os tubos de microcentrífuga por 10 min a 300 x g em RT. Descarte o sobrenadante dos tubos. Mover os tubos com pastilhas organoides para o gelo e adicionar o volume adequado de BECM a cada tubo de microcentrífuga (Tabela 1).
   NOTA: Como o BECM é viscoso, adicione volumes adicionais (aproximadamente 10% a 20% extras do volume da cúpula) do BECM para contabilizar a perda na ponta da pipeta.
4. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no BECM, tomando cuidado para não produzir bolhas.
5. Pipete lenta e cuidadosamente os organoides suspensos por BECM para a superfície de revestimento. Durante a pipetagnação, traga lentamente a pipeta para criar uma cúpula. Encha todos os poços vazios com PBS para manter a umidade.
6. Colocar a placa numa incubadora de 37 °C durante 1 h para permitir que o BECM se solidifique e, em seguida, cobrir com o volume de meio adequado (Tabela 1).

8. Incorporação de organoides no colágeno

1. Execute todas as etapas no gelo. Preparar a solução de colagénio combinando, por ordem sequencial, 375 μL de 10x DMEM, 100 μL de 1 N de hidróxido de sódio (NaOH) e 3 ml de solução de colagénio I de cauda de rato num tubo cónico de 15 ml. Misture a pipeta, tomando cuidado para não fazer bolhas. Titular a solução a um pH de 7,2-7,4 com pequenas quantidades (incrementos de 1-3 μL) de NaOH ou 10x DMEM, conforme necessário.
2. Revestir o fundo dos poços com a quantidade mínima de colágeno necessária para cobrir totalmente o fundo do poço. Uma abordagem é colocar uma pequena quantidade de colágeno e balançar a placa de um lado para o outro. Deixe que os revestimentos de colagénio se fixem a 37 °C durante 30 min-2 h.
3. Aliquotar a suspensão apropriada de organoides em tubos microcentrífugos de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de colágeno por poço (Tabela 1). Colocar numa incubadora de 37 °C.
4. Armazenar a solução de colágeno a 4 °C e monitorar a polimerização, verificando a formação de fibras sob um microscópio a cada 10 minutos. O colágeno atingirá a polimerização adequada entre 30 min-2 h.
   NOTA: A polimerização adequada pode ser determinada pela presença de fibras ramificadas em toda a matriz. Prossiga para a etapa 8.5 imediatamente uma vez que algumas fibras sejam observadas no campo de visão.
5. Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 300 x g durante 10 minutos a RT. Eliminar o sobrenadante dos tubos. Mover os grânulos organoides para o gelo e adicionar o volume apropriado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga (Tabela 1).
   NOTA: Como o colágeno é viscoso, adicione volumes adicionais (aproximadamente 10% a 20% extras do volume da cúpula) de colágeno para explicar a perda na ponta da pipeta.
6. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no colágeno, tomando cuidado para não produzir bolhas.
7. Pipete lenta e cuidadosamente os organoides suspensos de colágeno na superfície de revestimento. Durante a pipetagnação, traga lentamente a pipeta para criar uma cúpula. Encha todos os poços vazios com PBS para manter a umidade.
8. Colocar a placa numa incubadora de 37 °C durante 1 h para permitir a solidificação do colagénio e, em seguida, cobrir com o volume adequado de meio (Tabela 1).
9. NOTA: Os organoides mantêm a viabilidade em matriz 3D por até 7 dias. Se a imagem estiver sendo usada para análise, prossiga para as etapas 9 e 10.

9. Fixação de organoides incorporados

1. Use uma pipeta para remover todas as mídias dos poços sem fazer contato com as cúpulas de ECM.
2. Fixar com solução de paraformaldeído (PFA)/PBS a 4% por 5 min.
3. Lave duas a três vezes aplicando PBS em poços depois de colocá-los em um agitador de movimento lento. Após as lavagens, aplicar PBS fresco nas cúpulas e conservar a placa a 4 °C.

10. Coloração imunofluorescente de organoides embutidos

1. Preparação de soluções para coloração por imunofluorescência
   1. Tampão de permeabilização: Prepare uma solução de PBS com Triton X-100 a 10%.
   2. Buffer de bloqueio: Prepare uma solução PBS com 10% FBS e 0,2% Triton X-100.
   3. Tampão de diluição de anticorpos: Prepare uma solução de PBS com FBS a 2% e Triton X-100 a 0,2%.
2. Permeabilização e bloqueio
   1. Pipeta tampão de permeabilização suficiente para cobrir as cúpulas de ECM. Incubar por 1 h no RT em um agitador de movimento lento.
   2. Remova o tampão de permeabilização com uma pipeta e aplique o mesmo volume de tampão de bloqueio por 3 h.
3. Incubação de anticorpos primários
   1. Remova o tampão de bloqueio com uma pipeta e aplique o tampão de diluição de anticorpos que contém o anticorpo primário nas concentrações especificadas pelo fabricante. Incubar a amostra a 4 °C durante 12-16 h num agitador de movimento lento.
   2. Remova a solução primária de anticorpos e lave as amostras três vezes durante 10 minutos com PBS at RT num agitador de movimento lento.
4. Incubação secundária de anticorpos e coloração nuclear
   1. Aspirar a lavagem PBS restante e aplicar o tampão de diluição de anticorpos contendo anticorpos secundários em concentrações especificadas pelo fabricante. Além disso, adicione DAPI ou Hoechst (para rotular núcleos) ou faloidina (para rotular actina) ao tampão na proporção de 1:250. Incubar por 2-4 h em RT em um agitador de movimento lento.
   2. Remova a solução de anticorpos secundários e lave as amostras três vezes durante 10 minutos em PBS at RT num agitador. Conservar as amostras em PBS a 4 °C até à obtenção de imaginos.

Resultados

As imagens apresentadas na Figura 1 fornecem um exemplo de organoides epiteliais mamários do tipo selvagem e tumoral de tecidos humanos e de camundongos. Uma ilustração rápida do método de isolamento de organoides epiteliais por centrifugação diferencial é fornecida no fluxo de trabalho de desenho animado na Figura 1A, mostrando que os tecidos primários de diferentes espécies podem ser processados de maneiras quase idênticas, produzindo tecido epiteli...

Discussão

Diferentes métodos têm sido descritos na literatura para gerar organoides tumorais. Este protocolo destaca um método para gerar organoides tumorais diretamente do tumor sem passar despercebido. Utilizando esse método, os organoides tumorais são produtíveis poucas horas após o início do procedimento e geram organoides próximos a 100% viáveis em comparação com 70% relatados na literatura³¹. Em comparação, outros métodos requerem a passagem em série de células em organoides ao longo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM HEPES Buffer	Gibco	15630080
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-096
100x Glutamax	Life Technologies	35050-061	Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Life Technologies	51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0.2 µm filter flask	Fisher	#564-0020
Amphotericin B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
BSA Solution (32%)	Sigma	#A9576
Cholera Toxin	Sigma	C8052
CO2-Independent Medium	Gibco	18045-088
Collagenase A	Sigma	C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Sigma	D4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	D6546	Common basal medium
D-MEM/F12	Life Technologies	#10565-018	Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	#F0926
Gentamicin	Life Technologies	#15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644
Hydrocortisone	Sigma	H0396
Insulin	Sigma	#I9278
Matrigel	Corning	#354230	Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Rat Tail Collagen I	Corning	354236
RPMI-1640 media	Fisher	SH3002701
Trypsin	Life Technologies	27250-018