Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Resumo

O presente protocolo descreve o implante e a avaliação do melanoma em coroide murina utilizando tomografia de coerência óptica.

Resumo

O estabelecimento de modelos experimentais de melanoma de coroide é um desafio em termos da capacidade de induzir tumores na localização correta. Além disso, as dificuldades na observação in vivo do melanoma de coroide posterior limitam a localização do tumor e a avaliação do crescimento em tempo real. A abordagem aqui descrita otimiza as técnicas para o estabelecimento do melanoma de coroide em camundongos por meio de um procedimento de injeção de células B16LS9 subcoroidal em várias etapas. Para permitir a precisão na injeção nas pequenas dimensões da úvea do rato, o procedimento completo é realizado sob um microscópio. Primeiro, uma peritomia conjuntival é formada na área dorso-temporal do olho. Em seguida, um trato no espaço subcoroidal é criado inserindo uma agulha através da esclera exposta. Isto é seguido pela inserção de uma agulha romba no trato e a injeção de células de melanoma na coroide. Imediatamente após a injeção, a tomografia de coerência óptica (OCT) não invasiva é utilizada para determinar a localização e a evolução do tumor. O descolamento de retina é avaliado como preditor da localização e tamanho do tumor. O método apresentado permite a indução reprodutível de melanoma localizado em coroide em camundongos e a avaliação do crescimento tumoral em imagens ao vivo. Como tal, fornece uma ferramenta valiosa para o estudo de tumores intraoculares.

Introdução

O melanoma uveal (UMT) é a neoplasia maligna primária intraocular mais frequente em adultos. Aproximadamente 90% dos melanomas oculares originam-se de melanócitos da região coroide do trato uveal¹. A UMTT é uma importante causa de morbidade e mortalidade, pois estima-se que cerca de 50% dos pacientes desenvolvam doença metastática, sendo o fígado o principal sítio de metástase2. O tratamento precoce das lesões primárias pode reduzir a chance de metástases, porém nenhum tratamento efetivo previne a formação de metástases³.

O tratamento padrão do melanoma uveal inclui terapia de irradiação, que está associada à perda da visão devido à neuropatia óptica, retinopatia, síndrome do olho seco e catarata. A ressecção cirúrgica é tipicamente retardada até que o crescimento da lesão seja reconhecido e caracterizado. No entanto, esse atraso pode permitir o desenvolvimento de doença^{metastática4}. Em alguns casos, a enucleação fútil é necessária. É claro que esse procedimento radical compromete a visão e resulta em dramática deterioração estética.

Muitos esforços têm sido dedicados ao desenvolvimento de modelos experimentais para o estudo do melanoma uveal. Modelos animais pré-clínicos que permitam a avaliação precisa dessa malignidade são fundamentais para a investigação de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o melanoma uveal. Modelos animais experimentais de melanoma ocular baseiam-se principalmente na inoculação de células tumorais em camundongos, ratos e^coelhos5,6. Modelos em camundongos são custo-efetivos e amplamente utilizados para estudos de melanoma devido à sua rápida taxa de reprodução e alta similaridade genômica com humanos. A linhagem celular de melanoma cutâneo murino B16 é comumente utilizada para inocular camundongos C57BL6 e induzir tumores singênicos. Ao usar esse modelo para induzir melanoma uveal, os olhos portadores de tumor normalmente precisam ser enucleados 7-14 dias após a inoculação. Além disso, o B16 é um modelo altamente invasivo. A natureza imunoprivilegiada do olho suporta metástases, e as metástases podem tipicamente ser detectadas 3-4 semanas após a inoculação de células tumorais. Subculturas da linhagem B16 original exibem propriedades metastáticas distintas⁶. Por exemplo, a linhagem de melanoma de Queens tem alta taxa de metástase7,8. A linhagem celular B16LS9 possui morfologia de células dendríticas e foi derivada de metástases hepáticas de camundongos C57BL/6 injetados com a linhagem de melanoma cutâneo parental B16F1⁹. Quando injetadas no compartimento posterior do olho, essas células formaram tumores intraoculares, que histologicamente se assemelham ao melanoma uveal humano e formam metástases hepatoespecíficas em camundongos C57BL/6, mas não Balb/C10,11,12. Geneticamente, as células são caracterizadas por maior expressão do proto-oncogene c-met, que atua como receptor celular para o fator de crescimento de hepatócitos¹³. Em contraste, o B16F10, a^10ª passagem do B16 parental, metastatiza primariamente para os pulmões quando inoculado intraocularmente¹⁴. Tanto o B16F10 quanto o B16LS9 são pigmentados¹².

Vários desafios-chave limitam o sucesso de modelos de melanoma uveal murino. Primeiro, o refluxo de células tumorais pode levar a melanoma extraocular ou subconjuntival. Em segundo lugar, o crescimento tumoral após a inoculação intraocular de células de melanoma é frequentemente muito variável, dificultando a avaliação do tratamento e da evolução. Outra grande dificuldade é a capacidade limitada de acompanhar o crescimento tumoral in vivo. Embora imagens bioluminescentes, como a luciferase expressando tumores, sejam comumente usadas para monitorar o crescimento ocular do tumor^15,16, elas não podem fornecer informações sobre a localização intraocular do tumor. Portanto, a avaliação do tumor é tipicamente realizada após a enucleação do^olho10,17. Isso limita muito a capacidade de caracterizar a progressão tumoral e a resposta aos tratamentos extensivamente. Outro grande obstáculo no estudo do melanoma uveal é a dificuldade de monitoramento de lesões em camundongos pigmentados. Novas abordagens, que superem essas dificuldades, são necessárias para promover a pesquisa do melanoma uveal em modelos animais.

A tomografia de coerência óptica (OCT) fornece capacidades distintas para obter imagens profundas nas diferentes seções do olho em alta resolução, o que é incomparável com outras metodologias, incluindo a ultrassonografia^18,19. A OCT tem sido utilizada em modelos animais para o estudo de diversas doenças oculares²⁰. Recentemente, a OCT foi demonstrada como meio não invasivo para avaliar o crescimento tumoral^{intraocular21}. O protocolo aqui descrito descreve a implantação de células de melanoma na coroide murina e o uso da OCT para predizer a localização e o tamanho do tumor intraocular no momento da inoculação celular.

Protocolo

Os experimentos do protocolo foram aprovados pelo Conselho Nacional de Experimentação Animal de Israel e estão de acordo com a Declaração ARVO para uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e de Visão. Camundongos C57BL/6 fêmeas, com idade entre 8-10 semanas, foram utilizados para o presente estudo e foram expostos a ciclos claro-escuro de 12/12 h. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Cultura celular

1. Cultura de células B16LS9 em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 25 mM de HEPES, 1% de mistura vitamínica essencial, 200 U/mL de penicilina e 200 mg/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais), em estufa umidificada a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Colher as células para injeção a 70%-80% de confluência.

2. Preparação dos animais

1. Preparar uma mistura anestésica de cetamina (75 mg/kg de peso corporal) e medetomidina (0,5 mg/kg de peso corporal). Anestesiar os camundongos injetando a mistura anestésica intraperitonealmente em uma única injeção.
2. Aplicar anestésico oftálmico tópico oxibuprocaína (0,4%) em ambos os olhos.
3. Dilatar as pupilas de camundongos aplicando topicamente tropicamida (0,5%).

3. Criação de peritomia conjuntival e trato escleral no espaço subcoroidal

1. Aplicar 1,4% de hidroxietilcelulose (ver Tabela de Materiais) como lubrificante em ambos os olhos para evitar a secagem. Aplicar tropicamida a 0,5% no olho direito.
2. Observe o olho operado do camundongo sob um microscópio cirúrgico (ver Tabela de Materiais). Mantenha as pálpebras abertas com pinça intraocular estéril.
3. Com o uso de pinça intraocular, segurar a conjuntiva limbal súpero-temporal e tracionar em direção à posição infranasal²². Fixe essa posição mantendo-a durante todo o procedimento (Figura 1A).
4. Com uma ponta de agulha de 30 G, fazer uma pequena peritomia conjuntival (1-2 mm) na área dorso-temporal, aproximadamente 1-2 mm posterior ao limbo.
   OBS: O uso de agulhas mais finas pode evitar a punção excessiva e permitir melhor precisão da localização do tumor.
5. Remova o excesso de cápsula de Tenon da abertura da peritomia.
   OBS: A cápsula de Tenon é uma camada de tecido conjuntivo denso que envolve o globo ocular²².
6. Neste local, insira a ponta da agulha para penetrar através da esclera. Fazer uma excisão para criar um trato no espaço subcoroidal até que a cor marrom da coroide apareça através da substância branca exposta da esclera (Figura 1B).

Figura 1: Inoculação de células tumorais . (A) A conjuntiva limbal súpero-temporal é mantida com pinça intraocular e tracionada em direção à posição infranasal. (B) A ponta de uma agulha de 30 G é inserida para penetrar através da esclera, e a excisão é feita para criar um rastro no espaço subcoroidal. (C) Uma seringa carregada com células e montada com uma agulha 32 G é inserida na esteira, e as células são injetadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Inoculação de células de melanoma

1. Ressuspender 70.000 células B16LS9 em 2 μL de PBS. Esse valor é estimado por olho.
2. Coloque as células numa seringa Hamilton de vidro estéril de 10 μL (ver Tabela de Materiais) montada com uma agulha romba de 32 G torcida num ângulo de 45°.
3. Introduza a agulha da seringa carregada aproximadamente 2 mm na via criada no passo 3.
4. Injetar 2 μL de suspensão celular.
5. Segure a agulha no lugar após a injeção por 2-3 s até que todo o líquido tenha clareado.
6. Retire a agulha puxando-a suave e lentamente para evitar vazamento da esteira (Figura 1C).
   NOTAS: Ajustar a velocidade e a força de injeção pode afetar o padrão de desenvolvimento do tumor. Sugere-se que esses parâmetros sejam calibrados por indivíduos que experimentam para identificar a força e a velocidade corretas aplicadas. Um total de 70.000 células foi determinado em experimentos preliminares. No entanto, como pode haver variações nos tipos ou lotes de cultura celular ou entre linhagens de camundongos, a calibração desse número é necessária.

5. Avaliação do local da injeção

1. Observar o olho injetado por exames de OCT imediatamente após a inoculação de células de melanoma para identificar o aparecimento de descolamento de retina (DR), lesão retiniana e/ou células no vítreo²³.
   NOTAS: Reaplicar tropicamida, oxibuprocaína e etilcelulose conforme necessário.
2. Com base nos exames de OCT da etapa 5.1, classifique os padrões de DR²¹ de acordo com: (1) local RD-um local de DR; (2) vazamento para o material celular observador do vítreo no vítreo; (3) extensão de RD-múltiplos locais de RD.
3. Predizer a localização do tumor com base em: (1) tumores de coroide locais com DR esperada; (2) extravasamento para os tumores vítreos esperados no vítreo; (3) DR estendida variável esperada e tumores dispersos (Figura 2).
   NOTA: Espera-se que apenas camundongos com DR local (cerca de 50%) desenvolvam tumores limitados à coroide.

6. Predição do tamanho do tumor com base na altura da DR

1. Meça a altura da DR local nos exames de OCT usando um software de segmentação/análise de OCT (ver Tabela de Materiais) e classifique de acordo com os seguintes grupos: pequeno = <300 μm; média = 300-400 μm; grande = >400 μm.
2. Avaliar o volume que se espera que os tumores atinjam dentro de 5 dias após a injeção de acordo com os seguintes critérios:
   Uma pequena altura de DR é tipicamente observada em tumores de pequenas dimensões (volume tumoral variando de 0,0059 mm3 a 0,07^mm3, com volume médio de 0,027 ± 0,005^mm3).
   A altura média da DR é encontrada em tumores pequenos e médios (volume tumoral variando de 0,015 mm3 a 0,15 mm3, com volume médio de 0,056 ± 0,016^mm3).
   Uma grande altura da DR está associada a uma ampla faixa de volumes tumorais de até 0,36^mm3.
   OBS: A faixa de tamanhos esperados dos tumores foi obtida a partir dos resultados anteriores e dividida em três grupos de tumores pequenos, médios e grandes.

7. Procedimentos pós-operatórios

1. Aplicar ofloxacina oftálmica 0,3% topicamente.
2. Reverter a anestesia injetando cloridrato de atipamezol (3 mg/kg) por via subcutânea.
3. Injetar buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg/kg de peso corporal) duas vezes ao dia durante 3 dias para reduzir a dor e o sofrimento dos animais.
4. Aos 5 dias após a injeção das células do melanoma, avalie o tamanho do tumor seguindo os passos abaixo.
   1. Anestesiar os camundongos conforme descrito na etapa 2.1. Aplicar tropicamida (0,5%).
   2. Examine os olhos por meio de exames longitudinais e sagitais de OCT e use um software de segmentação/análise de OCT para medir o volume e a localização do tumor.
   3. Calcular o volume tumoral usando a fórmula²⁴: V = a*b*c*6/π (a, b e c = comprimento, largura e altura, respectivamente).
   4. Examinar o tamanho do tumor a cada 2-3 dias, conforme descrito nas etapas 7.4.1-7.4.3.
      Observação : o procedimento deve ser otimizado se usando diferentes cepas de mouse ou linhas de célula.

Resultados

Os olhos foram examinados via OCT imediatamente após a injeção das células B16LS9. Descolamento local de retina foi observado após a injeção. Os camundongos exibiram três padrões de RD: focal (Figura 2, painel superior), vazamento para o vítreo (Figura 2, painel médio) e RD estendida (Figura 2, painel inferior). A DR estendida é provavelmente causada por danos causados pela injeção. Houve associação entre o ...

Discussão

O melanoma uveal é uma doença devastadora para a qual novas abordagens terapêuticas são extremamente necessárias. No entanto, a pesquisa sobre melanoma uveal e potenciais tratamentos é limitada pelos desafios técnicos dos modelos animais de melanoma uveal ^1,25. Os tumores oculares, que são induzidos pela injeção intraocular de células cancerosas, são altamente variáveis em localização e tamanho, provavelmente devido às pequenas dimensões do olho ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)	Hamilton	721711
30 G needles	BD Microbalance	2025-01
Atipamezole hydrochloride	Orion Phrma
B16LS9 cells	from Hans Grossniklaus USA
Buprenorphine	richter pharma	102047
C57BL/6 female mice	Envigo
Essential vitamin mixture	satorius	01-025-1A
Fetal bovine serum	rhenium	10270106
HEPES	satorius	03-025-1B
Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops	Fisher Pharmaceutical	390862
InSight OCT segmentation software	Phoenix Micron, Inc
Ketamine	bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
L-glutamine	satorius	03-020-1B
Medetomidine	zoetis (vetmarket)	102532
Ofloxacin 0.3% eye drops	allergan	E92170
Optical coherence tomography	Phoenix Micron, Inc
Oxybuprocaine 0.4%	Fisher Pharmaceutical	393050
Penicillin-streptomycin-amphoteracin	satorius	03-033-1B
Phosphate buffered saline (PBS)	satorius	02-023-1a
RPMI cell media	satorius	01-104-1A
Sodium pyruvate	satorius	03-042-1B
Surgical microscope	Zeiss	OPMI-6 CFC
Tropicamide 0.5%	Fisher Pharmaceutical	390723