O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

Resumo

Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto altamente variável de defeitos estruturais e prejuízos cognitivos que surgem devido à exposição pré-natal ao etanol. Devido à complexa patologia do TEAF, modelos animais têm se mostrado críticos para nossa compreensão atual dos defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. O peixe-zebra provou ser um modelo poderoso para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol devido ao alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento entre peixes-zebra e humanos. Como um sistema modelo, o peixe-zebra possui muitos atributos que os tornam ideais para estudos de desenvolvimento, incluindo um grande número de embriões fertilizados externamente que são geneticamente tratáveis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem com precisão o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em vários contextos genéticos. Uma importante ferramenta genética disponível no peixe-zebra é a transgênese. No entanto, gerar construções transgênicas e estabelecer linhagens transgênicas pode ser complexo e difícil. Para resolver essa questão, os pesquisadores do peixe-zebra estabeleceram o sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon. Este sistema modular usa uma abordagem de clonagem de Gateway multisite para a montagem rápida de construções transgênicas completas baseadas em transposon Tol2. Aqui, descrevemos a caixa de ferramentas do sistema flexível Tol2 e um protocolo para geração de construções transgênicas prontas para a transgênese de peixe-zebra e seu uso em estudos de etanol.

Introdução

A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)^1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da....

Protocolo

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram criados e criados seguindo os protocolos estabelecidos pela IACUC¹². Esses protocolos foram aprovados pela Universidade de Louisville.

NOTA: A linhagem de peixe-zebra selvagem, AB, e a linhagem dupla mutante bmp4^st72;smad5^b1100 foram usadas neste estudo. Toda a água utilizada neste procedimento foi água de osmose reversa estéril. As imagens confocais foram obtidas em microscópio confocal de varredura a laser. As medidas da endoderme foram realizadas utilizando-se a ferramenta de medida do ImageJ. Todas as análises estatí....

Resultados

Para gerar as construções transgênicas, foi utilizado o sistema de transgênese Tol2. Três vetores de entrada, incluindo p5E, que contém os elementos promotores/potencializadores do gene, pME, que mantém o gene a ser expresso pelos elementos promotores/intensificadores, e p3E, que, no mínimo, contém a cauda poliA, foram usados para gerar a construção transgênica via clonagem LR de gateway multissite. O vetor de destino, pDest, fornece as repetições de Tol2 para a inserção genômica da construção.......

Discussão

Os peixes-zebra são ideais para estudar o impacto da exposição ao etanol no desenvolvimento e estados de doença ^7,8. Os peixes-zebra produzem um grande número de embriões translúcidos, fertilizados externamente e geneticamente tratáveis, o que permite a obtenção de imagens vivas de vários tecidos e tipos celulares marcados com transgenes simultaneamente em múltiplos contextos ambientais^19,20. .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene Tol2 toolbox	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air			Provided directly by the university
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
Analytical Balance	VWR	10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary	FHC	30-30-0
Calcium Chloride	VWR	97062-590
Chloramphenicol	BioVision	2486
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope	Olympus	SZX16
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906
Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	Fluoview FV1000
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar	Fisher Scientific	BP9724
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme	Fisher Scientific	12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate)	Fisher Scientific	M63-500
Micro Pipette holder	Applied Scientific Instrumentation	MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL	VWR	10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL	VWR	10025-716
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Micropipette tips 10 μL	Fisher Scientific	13611106
Micropipette tips 1000 μL	Fisher Scientific	13611127
Micropipette tips 200 μL	Fisher Scientific	13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit	Fisher Scientific	AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop	ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S
Petri dishes 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Phenol Red sodium salt	Sigma Aldrich	P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette	Gilson	FA10001M
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic)	VWR	BDH9266-500G
Pressure Injector	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Sodium Bicarbonate	VWR	BDH9280-500G
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system	Millipore	SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C404010
Vertical Pipetter Puller	David Kopf Instruments	720
Zebrafish microinjection mold	Adaptive Science Tools	i34