Avaliação da atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas in vitro

Resumo

Apresentamos quatro métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas usando técnicas in vitro . Estes métodos podem ser adaptados para estudar as interações de diferentes nanopartículas e superfícies nanoestruturadas com uma ampla gama de espécies microbianas.

Resumo

As atividades antimicrobianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas, como prata, óxido de zinco, dióxido de titânio e óxido de magnésio, têm sido exploradas anteriormente em ambientes clínicos e ambientais e em produtos alimentícios consumíveis. No entanto, a falta de consistência nos métodos experimentais e materiais utilizados tem culminado em resultados conflitantes, mesmo entre estudos dos mesmos tipos de nanoestruturas e espécies bacterianas. Para pesquisadores que desejam empregar nanoestruturas como aditivo ou revestimento em um projeto de produto, esses dados conflitantes limitam sua utilização em ambientes clínicos.

Para enfrentar esse dilema, neste artigo, apresentamos quatro diferentes métodos para determinar as atividades antimicrobianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas, e discutimos sua aplicabilidade em diferentes cenários. Espera-se que a adaptação de métodos consistentes leve a dados reprodutíveis que possam ser comparados entre estudos e implementados para diferentes tipos de nanoestruturas e espécies microbianas. Apresentamos dois métodos para determinar as atividades antimicrobianas de nanopartículas e dois métodos para as atividades antimicrobianas de superfícies nanoestruturadas.

Para nanopartículas, o método de co-cultura direta pode ser usado para determinar as concentrações inibitórias mínimas e bactericidas mínimas de nanopartículas, e o método de cultura de exposição direta pode ser usado para avaliar a atividade bacteriostática versus bactericida em tempo real resultante da exposição a nanopartículas. Para superfícies nanoestruturadas, o método de cultura direta é usado para determinar a viabilidade de bactérias indiretamente e diretamente em contato com superfícies nanoestruturadas, e o método de exposição de contato focado é usado para examinar a atividade antimicrobiana em uma área específica de uma superfície nanoestruturada. Discutimos as principais variáveis experimentais a serem consideradas para o planejamento de estudos in vitro na determinação das propriedades antimicrobianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas. Todos esses métodos são de custo relativamente baixo, empregam técnicas relativamente fáceis de dominar e repetíveis para consistência, e são aplicáveis a uma ampla gama de tipos de nanoestruturas e espécies microbianas.

Introdução

Somente nos EUA, 1,7 milhão de indivíduos desenvolvem uma infecção hospitalar adquirida (IRAS) anualmente, sendo que uma em cada 17 dessas infecções resulta em morte¹. Além disso, estima-se que os custos do tratamento das IRAS variem de US$ 28 bilhões a US$ 45 bilhões anuais ^1,2. Essas IACS são predominantes por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)^3,4 e Pseudomonas aeruginosa4^, que são comumente isoladas de infecções crônicas de feridas operatórias e geralmente requerem tratamento extenso e tempo para produzir uma evolução favorável do paciente.

Ao longo das últimas décadas, várias classes de antibióticos foram desenvolvidas para tratar infecções relacionadas a essas e outras bactérias patogênicas. Por exemplo, análogos da rifamicina têm sido usados para tratar MRSA, outras infecções gram-positivas e gram-negativas e infecções por Mycobacterium ^spp.5. Na década de 1990, para tratar efetivamente um número crescente de infecções por M. tuberculosis, drogas adicionais foram combinadas com análogos da rifamicina para aumentar sua eficácia. Entretanto, cerca de 5% dos casos de M. tuberculosis permanecem resistentes àrifampicina^5,6, e há uma preocupação crescente com bactérias multirresistentes⁷. Atualmente, o uso isolado de antibióticos pode não ser suficiente no tratamento das IRASs, o que tem provocado uma busca contínua por terapias antimicrobianas alternativas¹.

Metais pesados, como prata (Ag)8,9,10 e ouro (Au)11, e cerâmicas, como dióxido de titânio (TiO 2)12 e óxido de zinco (ZnO)¹³, na forma de nanopartículas (NP) (AgNP, AuNP, TiO₂ NPe ZnONP, respectivamente) têm sido examinados quanto às suas atividades antimicrobianas e têm sido identificados como potenciais alternativas antibióticas. Além disso, materiais bioreabsorvíveis, como ligas de magnésio (ligas de Mg)14,15,16, nanopartículas de óxido de magnésio17,18,19,20,21 e nanopartículas de hidróxido de magnésio [nMgO e nMg(OH)₂, respectivamente]^22,23,24, também foram examinados. No entanto, os estudos antimicrobianos prévios de nanopartículas utilizaram materiais e métodos de pesquisa inconsistentes, resultando em dados difíceis ou impossíveis de comparar e, por vezes, de natureza contraditória^18,19. Por exemplo, a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) das nanopartículas de prata variaram significativamente em diferentes estudos. Ipe et ^al.25 avaliaram a atividade antibacteriana de AgNPs com tamanho médio de partícula de ~26 nm para determinar as CIMs contra bactérias gram-positivas e gram-negativas. As CIMs identificadas para P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA foram 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL, respectivamente. Em contraste, Parvekar et ^al.26 avaliaram AgNPs com tamanho médio de partícula de 5 nm. Neste caso, a CIM de AgNP e uma CBM de 0,625 mg/mL mostraram-se eficazes contra S. aureus. Além disso, Loo et ^al.27 avaliaram AgNPs com tamanho de 4,06 nm. Quando E. coli foi exposta a essas nanopartículas, a CIM e a CBM foram relatadas a 7,8 μg/mL. Finalmente, Ali et ^al.28 investigaram as propriedades antibacterianas de AgNPs esféricas com tamanho médio de 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA foram expostas a essas nanopartículas, a CIM foi identificada a 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL e 36 μg/mL, respectivamente, e a CBM foi identificada a 36 μg/mL, 42 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente.

Embora a atividade antibacteriana das nanopartículas tenha sido extensivamente estudada e relatada durante as últimas décadas, não há um padrão para os materiais e métodos de pesquisa usados para permitir comparações diretas entre os estudos. Por esta razão, apresentamos dois métodos, o método de co-cultivo direto (método A) e o método de exposição direta (método B), para caracterizar e comparar as atividades antimicrobianas de nanopartículas, mantendo os materiais e métodos consistentes.

Além das nanopartículas, superfícies nanoestruturadas também têm sido examinadas quanto a atividades antibacterianas. Estes incluem materiais à base de carbono, como nanofolhas de grafeno, nanotubos de carbono e grafite²⁹, bem como ligas puras de Mg e Mg. Cada um desses materiais exibiu pelo menos um mecanismo antibacteriano, incluindo danos físicos impostos às membranas celulares por materiais à base de carbono e danos a processos metabólicos ou DNA através da liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) quando o Mg se degrada. Além disso, quando zinco (Zn) e cálcio (Ca) são combinados na formação de ligas de Mg, o refinamento do tamanho de grão da matriz de Mg é aumentado, o que leva a uma redução na adesão bacteriana às superfícies do substrato em comparação com amostras somente de Mg¹⁴. Para demonstrar a atividade antibacteriana, apresentamos o método de cultura direta (método C), que determina a adesão bacteriana sobre e ao redor de materiais nanoestruturados ao longo do tempo através da quantificação de unidades formadoras de colônias bacterianas (UFCs) com contato superficial direto e indireto.

A geometria das nanoestruturas nas superfícies, incluindo o tamanho, a forma e a orientação, pode influenciar as atividades bactericidas dos materiais. Por exemplo, Lin et ^al.16 fabricaram diferentes camadas nanoestruturadas de MgO nas superfícies de substratos de Mg por anodização e deposição eletroforética (EPD). Após um período de exposição à superfície nanoestruturada in vitro, o crescimento de S. aureus foi substancialmente reduzido em comparação com o Mg não tratado. Isso indicou uma maior potência da superfície nanoestruturada contra a adesão bacteriana em relação à superfície metálica não tratada com Mg. Para revelar os diferentes mecanismos das propriedades antibacterianas de várias superfícies nanoestruturadas, um método de exposição por contato focado (método D) que determina as interações célula-superfície dentro da área de interesse é discutido neste artigo.

O objetivo deste artigo é apresentar quatro métodos in vitro aplicáveis a diferentes nanopartículas, superfícies nanoestruturadas e espécies microbianas. Discutimos as principais considerações para cada método para produzir dados consistentes e reprodutíveis para comparabilidade. Especificamente, o método de co-cultura direta¹⁷ e o método de exposição direta são usados para examinar as propriedades antimicrobianas de nanopartículas. Através do método de co-cultivo direto, as concentrações inibitórias mínimas e bactericidas mínimas (CIM e CBM_90-99,99, respectivamente) podem ser determinadas para espécies individuais_, e a concentração mais potente (CPM) pode ser determinada para várias espécies. Através do método de exposição direta, os efeitos bacteriostáticos ou bactericidas das nanopartículas em concentrações inibitórias mínimas podem ser caracterizados por leituras de densidade óptica em tempo real ao longo do tempo. O método de cultura direta¹⁴ é adequado para examinar bactérias direta e indiretamente em contato com superfícies nanoestruturadas. Finalmente, o método focused-contact^{exposure 16} é apresentado para examinar a atividade antibacteriana de uma área específica em uma superfície nanoestruturada através da aplicação direta de bactérias e da caracterização do crescimento bacteriano na interface célula-nanoestrutura. Este método é modificado a partir da norma industrial japonesa JIS Z 2801:2000¹⁶, e destina-se a focar nas interações micróbio-superfície e excluir os efeitos da degradação da amostra em massa em cultura microbiana sobre as atividades antimicrobianas.

Protocolo

Para apresentar os métodos de co-cultivo direto e exposição direta, usamos nanopartículas de óxido de magnésio (nMgO) como material modelo para demonstrar interações bacterianas. Para apresentar os métodos de cultura direta e exposição por contato focado, usamos uma liga de Mg com superfícies nanoestruturadas como exemplos.

1. Esterilização de nanomateriais

NOTA: Todos os nanomateriais devem ser esterilizados ou desinfetados antes da cultura microbiana. Os métodos que podem ser usados incluem calor, pressão, radiação e desinfetantes, mas a tolerância dos materiais para cada método deve ser identificada antes dos experimentos in vitro .

1. Nanopartículas
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas em um solvente orgânico como etanol ou embaladas em um prato ou caixa seguido de esterilização ou desinfecção de maneira apropriada. As nanopartículas foram esterilizadas utilizando-se o seguinte método para demonstração do método de co-cultura direta¹⁷ e método de exposição direta.
   1. Esterilizar nanopartículas de MgO em estufa de convecção^{30 °C a 200} °C por 60 min antes de cada experimento in vitro .
      OBS: Este método foi escolhido porque o vapor de água e a luz UV podem afetar as estruturas das nanopartículas de MgO (nMgO)¹⁷.
2. Materiais a granel
   OBS: Os materiais nanoestruturados foram esterilizados pelo seguinte método para demonstração do método de cultura direta.
   1. Para o método de cultura direta¹⁴, desinfetar amostras ZC21, Mg e T64 preparadas usando radiação ultravioleta (UV) por 4 h antes de iniciar os estudos in vitro .
   2. Para o método de exposição por contacto focalizado¹⁶, desinfetar todas as amostras utilizando radiação UV durante 2 h antes do início dos estudos in vitro .
3. Alternativamente, use óxido de etileno (ETO) para a esterilização de materiais sensíveis ao calor.

2. Método de co-cultura direta (método A)

NOTA: No método A, bactérias em uma cultura de semeadura em fase lag são diretamente misturadas com nanopartículas de determinadas concentrações. Para o exame da atividade antimicrobiana de nanopartículas, seguimos um protocolo descrito por Nguyen et ^al.17.

1. Caracterização de nanopartículas e nanoestruturas
   NOTA: A composição e a forma da nanoestrutura são confirmadas usando difração de pó de raios X.
   1. Medição de nanopartículas
      1. Pesar as nanopartículas a 9x a massa desejada por mL para acomodar amostras de 3 mL em triplicata. Por exemplo, pesar 0,2 mg/mL nMgO a 1,8 mg/mL.
         NOTA: Isso garante a distribuição consistente de nanopartículas nas culturas bacterianas e caldos.
      2. Medir todas as nanopartículas em um tubo de microcentrífuga de 5,0 mL que foi pré-pesado e usando uma balança analítica.
2. Preparação e cultivo de culturas de bactérias
   1. Para cada experimento in vitro , recuperar estoques de células de bactérias do armazenamento a -80 °C. Adicionar 10 μL de cada estoque de células de bactérias em 5 mL de um meio de crescimento apropriado.
   2. Colocar o meio inoculado numa incubadora-agitadora a 37 °C e 250 rpm durante aproximadamente 16 h durante a noite.
      1. Se as espécies de Staphylococcus forem cultivadas, subcultivar colocando 400 μL de cada cultura noturna em 20 mL de meio de crescimento fresco (100 μL/5 mL de meio) e incubar com agitação a 37 °C e 250 rpm por mais 4-6 h.
3. Lavagem e contagem das células bacterianas para determinar a densidade de semeadura
   NOTA: A densidade de semeadura desejada de 7,8 × 10⁶ UFC/mL foi identificada como o número de células maior do que o necessário para confirmar uma infecção do trato urinário.
   1. Coletar bactérias cultivadas aliquotando 1 mL da cultura de bactérias durante a noite em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Crie um número suficiente de alíquotas de culturas bacterianas durante a noite e centrifugue-as por 10 min a 1.956 × g para atingir as densidades de semeadura desejadas.
   2. Após a centrifugação, pipetar para remover o sobrenadante das células peletizadas e colocar o sobrenadante em um recipiente de coleta. Ressuspender os pellets celulares em 0,5 mL de meio de cultura fresco. Combinar duas suspensões de 0,5 mL para criar 1 mL de suspensão para reduzir o número de alíquotas de 1 mL de células ressuspensas para seis. Repetir a centrifugação por 10 min a 1.956 × g.
   3. Completar um segundo ciclo de lavagem utilizando meio de crescimento fresco, como na etapa 2.3.2, para reduzir para três o número de alíquotas de 1 mL de células lavadas ressuspensas.
   4. Completar o terceiro ciclo, como na etapa 2.3.2, exceto ressuspender os pellets celulares em 0,33 mL de tampão Tris (hidroximetil) amonmetano (tampão Tris, pH 8,5). Combinar as três suspensões, cada uma com volume de 0,33 mL, em uma microcentrífuga de 1,5 mL. Repetir a centrifugação por 10 min a 1.956 × g.
      NOTA: Tris buffer não contém Mg 2+ ou Ca²⁺ íons³¹. Isso é importante para o uso de espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) para medir íons Mg 2+ e Ca²⁺ em caldos pós-cultura. Em contraste, os fosfatos presentes na solução salina tamponada com fosfato (PBS)32, por exemplo, sequestram ambos os íons Mg 2+ ou Ca^{2+ 33,34,35} e causam confusão na interpretação dos dados da ICP-OES.
   5. Remova o sobrenadante das células peletizadas. Ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão Tris fresco, conhecido como suspensão celular - uma cultura de semeadura bacteriana em fase lag.
   6. Determinar a concentração de suspensão celular (células/mL) usando um hemocitômetro.
4. Criação da cultura de bactérias semeadoras
   NOTA: A amostra tem um volume total de 3 mL e é completada em triplicata (9 mL no total).
   1. Determinar o volume total de cultura de semeadura de bactérias necessária. Para criar a cultura de semeadura, useC 1 V₁ = C 2 V₂para calcular o volume da suspensão celular necessária para criar uma cultura de semeadura de 7,8 × 10⁶ células/mL. Adicionar o volume calculado da suspensão celular (V₁) ao volume necessário de meio de crescimento (V₂).
   2. Determinar a densidade real de semeadura de bactérias em UFC/mL. Crie uma diluição em série dez vezes para ^10-4. Espalhe a diluição de ^10-4 no ágar de crescimento apropriado e incube durante a noite. Após a incubação, conte o número de colônias e calcule a UFC/mL.
5. Formação de bactérias e culturas de nanopartículas
   1. Em placas de poliestireno não tratadas com tecidos de 12 poços, alíquota de 2 mL da cultura de semeadura bacteriana em cada poço para o número de poços necessários.
   2. Para cada tubo de microcentrífuga de 5 mL contendo nMgO pré-pesado, adicionar 3 mL da cultura de semeadura bacteriana. Vórtice brevemente para misturar o nMgO com as bactérias. Alíquota 1 mL da mistura em três poços separados para criar as amostras triplicadas de cada peso pré-medido de nMgO. Pipetar a mistura bactéria/nMgO 2-3x antes de cada alíquota de 1 mL ser feita para manter o nMgO em suspensão.
      OBS: As amostras-controle serão constituídas por 3 mL somente de células, 3 mL somente de meio e 3 mL contendo as menores e maiores concentrações de nanopartículas utilizadas. Estes são preparados como na etapa 2.5.2. Todas as amostras de controle são completadas em triplicata.
   3. Incubar todas as placas de 12 poços a 37 °C e 120 rpm durante 24 horas.
6. Determinação do crescimento celular bacteriano após exposição a nMgO
   1. Após a incubação noturna das culturas bacterianas, coletar cada amostra de 3 mL por pipetagem em um tubo cônico individual de 15 mL.
   2. Use uma placa de 96 poços para criar diluições seriais 1:10. Determinar o número de colunas necessárias para diluir em série todas as amostras contendo bactérias. Adicione 180 μL de tampão Tris a cada poço da linha B à linha G para obter o número apropriado de colunas.
   3. Vórtice brevemente cada tubo cônico de 15 mL contendo amostras bacterianas e adicione 50 μL a um poço individual na linha A.
   4. Para cada poço da linha A, transfira 20 μL para a linha B (por exemplo, A1 a B1) e misture brevemente por pipetagem para obter um volume de 200 μL. Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira 20 μL do poço na linha B para o poço na linha C. Continue este padrão até que o poço na linha G contenha 200 μL, completando uma diluição em série de 10−¹ na linha B a 10⁻⁶ na linha G.
   5. Pipetar 100 μL de cada poço em uma placa de ágar de crescimento apropriada e espalhar pela placa para dispersar a cultura celular. Colocar as placas numa incubadora-agitadora durante a noite a 37 °C. Incubar as placas a 37 °C durante 24 horas.
   6. Examine as placas e conte aquelas que têm aproximadamente 25-300 colônias. Se possível, escolha placas com o mesmo valor de diluição. Use o número de colônias por placa para calcular a UFC/mL.
7. Avaliação do pH pós-incubação
   NOTA: Siga as instruções do fabricante para cada modelo de medidor de pH.
   1. Pré-calibre um medidor de pH usando soluções padronizantes de pH 4, pH 7 e pH 10. Leia cada amostra bacteriana colocando a sonda de pH no tubo cônico de 15 mL.
8. Preparação de amostras para ICP-OES
   NOTA: ICP-OES é usado para determinar a concentração de íons Mg 2+ e Ca²⁺. Esses cátions são considerados importantes, pois cada um participa do metabolismo celular.
   1. Centrifugar cada tubo cônico de 15 mL preparado na etapa 2.6.1 por 5 min a 5.724 × g para pellet os detritos celulares e nanoparticulados.
   2. Usando um tubo cônico de 15 mL, diluir 30 μL do sobrenadante em 2,97 mL de água filtrada de 18,2 Ω para criar uma diluição de 1:100.
      NOTA: O factor de diluição pode ser ajustado com base nas concentrações projectadas dos iões e no limite de detecção do instrumento espectrómetro.
   3. Leia as amostras usando ICP-OES.

3. Método de exposição directa (método B)

NOTA: Se a taxa de crescimento das bactérias escolhidas é desconhecida, então uma padronização da curva de crescimento deve ser concluída antes de implementar este método.

1. Determinar as atividades bacteriostáticas e bactericidas em tempo real após a exposição às nanopartículas de interesse.
   1. Preparar as concentrações desejadas de nanopartículas utilizando os métodos descritos na etapa 2.1-2.1.2.2. Preparar dois conjuntos de cada peso de nanopartículas a serem utilizados: um a ser adicionado a alíquotas de 3 mL de cultura de bactérias na fase logarítmica de crescimento, e outro a ser adicionado a alíquotas de 3 mL de meio de cultura sem bactérias como grupos controle.
   2. Determinar os antibióticos bacteriostáticos e bactericidas apropriados para as espécies de bactérias a serem testadas.
      NOTA: É necessário conhecimento da concentração inibitória mínima para cada antibiótico.
2. Calcular o volume total de cultura bacteriana necessário para amostras de 3 mL em triplicata para todas as amostras de nanopartículas, antibióticos e controle.
   NOTA: É necessário um volume igual de meio de crescimento estéril. Se o uso da espectrofotometria for planejado, isso requer ajustes no volume total necessário para acomodação do volume de 0,5 mL a 1,0 mL necessário para as cubetas.
3. Dia 1: Para cada experimento in vitro, crie estoques noturnos seguindo a etapa 2.2.1-2.2.2.
4. Dia 2: Confirme se as configurações do leitor de placas podem acomodar uma placa de 96 poços com uma densidade óptica de 600 nm. Medir as amostras em alíquotas de 200 μL usando uma placa de 96 poços.
   1. Determinar uma cultura bacteriana inicial OD₆₀₀ a 0,01 - a densidade usada para iniciar o período de incubação inicial antes da adição de nanopartículas e antibióticos.
   2. Coletar a cultura de bactérias durante a noite da incubadora-agitadora.
      1. Para cada material (por exemplo, nanopartículas pré-medidas ou antibióticos) a ser testado, crie uma cultura bacteriana separada em um OD₆₀₀ de 0,01. Use um recipiente grande o suficiente para acomodar o volume de cultura celular necessário (por exemplo, um frasco de Erlenmeyer esterilizado ou tubos cônicos de 50 mL).
      2. Diluir as amostras bacterianas noturnas com meio de crescimento colocando três alíquotas de 200 μL do meio de crescimento em três poços e três alíquotas de 200 μL da cultura bacteriana em poços adicionais (por exemplo, A1 a A6).
      3. Coloque a placa de 96 poços no leitor de placas e digitalize-a.
         NOTA: As leituras são calculadas em média para cada poço digitalizado para produzir um valor médio.
      4. Para calcular a densidade de bactérias em suspensão, faça a média do valor médio de cada poço contendo uma amostra em triplicata.
      5. Para determinar a densidade óptica das bactérias, subtraia a média da amostra de caldo da média bacteriana.
      6. Se for necessário continuar a ajustar a suspensão bacteriana, continue a adicionar caldo ou cultura bacteriana durante a noite, conforme necessário, e repita a varredura no leitor de placas, conforme necessário, até que um OD₆₀₀ de aproximadamente 0,01 seja alcançado.
      7. Incubar a 37 °C com agitação a 150 rpm até atingir o crescimento logarítmico.
5. Remova as culturas bacterianas do agitador da incubadora.
   1. Alíquota 3 mL da cultura bacteriana OD₆₀₀ 0,01 em tubos cônicos marcados de 15 mL para amostras teste e controle em triplicata.
   2. Alíquota 200 μL da cultura bacteriana em três poços de uma placa de 96 poços e medir as amostras usando o leitor de placas.
   3. Calcule as leituras conforme descrito anteriormente nas etapas 3.4.2.2 e 3.4.2.6 – a "leitura de -0,5 h".
6. Criação e medição de misturas bactérias/nanopartículas
   1. Alíquota 3 mL de meio de crescimento estéril em número igual ao das culturas bacterianas em tubos cônicos marcados de 15 mL para amostras controle (em triplicata).
   2. Para preparar suspensões de bactérias/nanopartículas e suspensões de meios/nanopartículas estéreis, remova 1 mL de cultura ou meio bacteriano de cada conjunto triplicado de tubos cônicos de 15 mL.
      1. Coloque as alíquotas de 1 mL em um tubo de centrífuga de 5 mL contendo nanopartículas pré-medidas e vórtice brevemente para misturar.
      2. Do tubo centrífugo de 5 mL, retornar alíquotas de 1 mL das suspensões de bactérias/nanopartículas ou meio/nanopartículas para o tubo cônico de 15 mL para distribuir as nanopartículas homogeneamente.
         NOTA: Pipetar a mistura bactéria/nanopartícula 2x-3x antes de cada alíquota de 1 mL ser pipetada para manter as nanopartículas em suspensão.
7. Criação e medição de misturas de bactérias/antibióticos
   1. Para criar as culturas bacterianas/antibióticas, alíquota 3 mL da cultura bacteriana incubada nos tubos cônicos de 15 mL correspondentemente marcados.
   2. Depois que todas as amostras tiverem sido preparadas, alíquota 200 μL de cada amostra nos poços individuais de uma placa de 96 poços.
   3. Coloque a(s) placa(s) no leitor de chapas e inicie a digitalização - a leitura de "0 h".
   4. Colocar os tubos cónicos de 15 ml que contêm as amostras numa incubadora-agitadora a 37 °C e a 150 rpm. Registar todos os dados conforme descrito anteriormente nos passos 3.4.2.2 e 3.4.2.6.
8. Aproximadamente 15 min após completar a leitura de 0 h, repita os passos descritos na etapa 3.7.2-3.7.3 - a leitura de "0,5 h".
   1. Após a 0 h estabelecida, repetir os passos descritos na etapa 3.7.2 - 3.7.3 a cada 90 min por seis ciclos; Completo em 9 h.
   2. Após a conclusão do sexto ciclo, colocar as amostras na incubadora-agitadora durante mais 15 h a 37 °C e 150 rpm. Repita os passos descritos nos passos 3.7.2-3.7.3 para obter a leitura de 24 horas. Registar todos os dados conforme descrito anteriormente nos passos 3.4.2.2 e 3.4.2.6.

4. Método de cultura direta (método C)

NOTA: No método C, bactérias em cultura de semeadura em fase lag são colocadas diretamente sobre as superfícies nanoestruturadas de interesse. Para o exame das atividades antimicrobianas da nanoestrutura, seguimos um protocolo descrito por Zhang et ^al.14. Para demonstrar este método de cultura direta, ZC21 (Mg-Zn-Ca Alloy) e pinos de Mg foram usados como amostras.

1. Preparação e cultivo das culturas de bactérias
   1. Para cada experiência in vitro, criar existências nocturnas seguindo o passo 2.2.1-2.2.2.
2. Lavar e contar as bactérias para determinar a densidade de semeadura
   NOTA: A densidade de semeadura desejada de 7,5 × 10⁵ UFC/mL foi identificada como a concentração celular relatada que causa infecções ortopédicas¹⁴.
   1. Recupere a cultura bacteriana durante a noite da incubadora-agitadora.
   2. Lavar e recolher as bactérias, seguindo o passo 2.3.2-2.3.2.3, mas substituir o meio fresco por fluido corporal simulado revisto (rSBF) para cada etapa de lavagem.
      NOTA: rSBF é uma solução tampão que imita a concentração iônica do plasma sanguíneo humano. No entanto, o rSBF contém apenas compostos inorgânicos, e está sem quaisquer compostos bioorgânicos, tais como proteínas. Para resolver isso, o soro fetal bovino (SFB) é combinado com rSBF para simular a composição do sangue humano para mimetizar melhor a formação natural de apatita em tecidos calcificados em condições experimentais³⁶.
   3. Remova o sobrenadante das células peletizadas. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de rSBF suplementado com 10% de FBS - a suspensão celular.
   4. Determinar a concentração de suspensão celular (células/mL) usando um hemocitômetro. Diluir a suspensão celular para uma concentração de 7,5 × 10⁵ células/mL em rSBF suplementado com FBS a 10%. Crie uma cultura de propagação seguindo a etapa 2.4.1.
   5. Determinar a densidade de semeadura real de acordo com o passo 2.4.2.
3. Distribuir a suspensão de células bacterianas nas amostras nos poços de cultura.
   1. Coloque as amostras e as amostras de controle nos poços individuais de uma placa de poliestireno não tratada com tecidos de 48 poços.
   2. Alíquota 0,75 mL da suspensão celular em cada poço contendo as amostras e controles. Coloque a(s) placa(s) de 48 poços em uma incubadora-agitadora por 24 h a 37 °C com agitação a 120 rpm.
4. Caracterização da concentração bacteriana
   1. Após 24 h de incubação, coletar as amostras e colocá-las em tubos de coleta separados e marcados.
   2. Coletar duas amostras de cada grupo e colocá-las individualmente em tubos de microcentrífuga marcados com 5,0 mL. Adicionar 2 mL de rSBF a cada tubo.
   3. Colocar as amostras recolhidas no passo 4.4.2 num banho de sonicação e sonicar durante 10 minutos. Após cada período de 5 min, vórtice cada amostra por 5 s.
   4. Recolher o rSBF que contém as células bacterianas recém-destacadas e colocar a suspensão num tubo de microcentrífuga fresco marcado.
5. Diluições seriadas e plaqueamento das bactérias
   1. Diluir em série e plaquear a suspensão bacteriana seguindo os passos 2.6.2-2.6.6.
6. Avaliar o pH pós-incubação dos meios de cultura seguindo o passo 2.7.
7. Prepare o meio de pós-cultura para ICP-OES seguindo os métodos descritos na etapa 2.8.

5. Método de exposição por contacto focalizado (método D)

NOTA: No método D, bactérias em um papel de filtro de nitrocelulose são colocadas em contato direto com uma área de interesse nas superfícies nanoestruturadas. Este método minimiza a interferência da degradação de amostras brutas em culturas bacterianas com as atividades bacterianas. Para examinar as atividades antimicrobianas de nanosuperfície, seguimos um protocolo descrito por Lin et ^al.16.

1. Siga os procedimentos na etapa 2.2.1-2.2.2.1 para criar uma cultura de semeadura bacteriana. Confirme a densidade de semeadura real seguindo a etapa 2.4.2.
2. Preparar as amostras para um tamanho de 1 × 1 cm² em forma quadrada. Preparar todos os tipos de amostra em triplicata. Se necessário, coloque as amostras num suporte tridimensional (3D) com 15 mm de diâmetro por 10 mm de altura. Coloque a amostra e o suporte num poço de uma placa de poço de poliestireno não tratada com cultura de tecidos.
3. Prepare papéis de nitrocelulose esterilizados aparando cada um até um diâmetro de 1 cm. Coloque os papéis de nitrocelulose preparados numa placa de ágar contendo o meio adequado.
4. Pipetar 50 μL da cultura bacteriana diluída sobre o papel de filtro.
5. Pipetar 50 μL de um meio apropriado no centro de cada superfície da amostra.
6. Usando pinças esterilizadas, pegue o papel nitrocelulose da superfície do ágar. Vire cuidadosamente o papel nitrocelulose e coloque-o na superfície da amostra para que as bactérias entrem em contato com os 50 μL do meio e a superfície nanoestruturada de interesse.
7. Adicionar 1 ml de tampão Tris a cada poço contendo uma amostra para manter a humidade. Incubar a placa de poço de poliestireno contendo todas as amostras a 37 °C durante 24 horas.
8. Recolher o papel nitrocelulose de cada superfície da amostra. Coloque cada um em 5 mL de tampão Tris. Vórtice os papéis filtrantes coletados e amostras de material nanosuperficial por 5 s.
9. Sonicate cada amostra por 10 min. Vórtice por 5 s após 5 min e novamente após 10 min.
10. Recolher as suspensões tampão Tris de todas as amostras e colocar cada volume em tubos de recolha frescos individuais.
11. Diluir em série e plaquear as amostras de acordo com o passo 2.6.2-2.6.6.

6. Caracterização pós-cultivo de bactérias e nanomateriais

1. Exame da adesão e morfologia bacteriana por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
   1. Após a incubação durante a noite, adicione glutaraldeído a 10% em cada poço da placa de poliestireno não tratada com tecido de 48 poços até que as amostras estejam totalmente cobertas. Incubar as amostras por 1 h para fixar as células bacterianas.
   2. Aspirar o glutaraldeído para um frasco de resíduos e enxaguar todas as amostras 3x com solução tampão Tris para remover bactérias não aderentes.
   3. Desidratar as amostras usando 30%, 75% e 100% de etanol por 30 min cada¹⁶.
      OBS: Recomenda-se o uso de um secador de ponto crítico para secar as amostras. Não é ideal secar as amostras à temperatura ambiente durante 24 horas.
   4. Use fitas adesivas condutoras, como fitas de cobre ou carbono, para fixar as amostras em um esboço de MEV. Revestir as superfícies da amostra por meio de revestimento de pulverização para fornecer condutividade antes da imagem (por exemplo, revestir placas de Mg com bactérias aderidas sob platina/paládio (Pt/Pd) por 45 s a 20 mA¹⁶).
      NOTA: Os materiais de revestimento, o tempo de processamento e a corrente de operação podem variar dependendo dos tipos de amostra.
   5. Tire imagens das bactérias nas amostras usando MEV com uma distância de trabalho apropriada e tensão de aceleração e nas ampliações desejadas. Por exemplo, use um MEV com um detector de elétrons secundário para obter imagens a uma distância de trabalho de 5 mm e uma tensão de aceleração de 10 kV¹⁶.
2. Examinar a morfologia superficial de amostras de nanomateriais pós-cultura usando MEV.
   1. Para nanomateriais, lave as amostras usando tampão Tris 3x para remover as bactérias livres que não estão aderidas à amostra. Para nanopartículas, disperse as partículas em um solvente que não afete as propriedades da amostra através de ultrassom para obter melhor dispersão quando necessário.
   2. Secar as amostras após o procedimento de lavagem.
   3. Use fitas adesivas dupla face de carbono ou cobre para aderir as amostras ao esboço de MEV.
   4. Crie uma camada superficial condutora de Pt/Pd usando um aplicador de pulverização, conforme descrito na etapa 6.1.4, antes da aquisição de imagens. Pegue as imagens de amostra conforme descrito na etapa 6.1.5.
   5. Analise a composição elementar da superfície usando EDS com uma tensão de aceleração apropriada e nas ampliações desejadas (por exemplo, a 10 kV após a realização da análise por MEV¹⁶).
3. Imagem de fluorescência da adesão bacteriana
   1. Preparar as amostras a serem visualizadas por microscopia de fluorescência, lavando-as primeiro com tampão Tris 3x. Secar ao ar as amostras à temperatura ambiente.
   2. Corar cada amostra com 10 μM de corante de fluorescência tioflavina T, seguindo o protocolo estabelecido³⁷.
   3. Realize imagens de fluorescência da adesão bacteriana usando um microscópio invertido acoplado a uma câmera digital acoplada a um dispositivo de carga multiplicadora de elétrons.

Resultados

A identificação da atividade antibacteriana de nanopartículas de óxido de magnésio e superfícies nanoestruturadas foi apresentada usando quatro métodos in vitro que são aplicáveis em diferentes tipos de materiais e espécies microbianas.

O método A e o método B examinam as atividades bacterianas quando expostas a nanopartículas em uma fase lag (método A) e fase logarítmica (método B) por uma duração de 24 h ou mais. O método A fornece resultados referentes à CIM e C...

Discussão

Apresentamos quatro métodos in vitro (A-D) para caracterizar as atividades antibacterianas de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas. Embora cada um desses métodos quantifique o crescimento e a viabilidade bacteriana ao longo do tempo em resposta aos nanomateriais, existe alguma variação nos métodos usados para medir a densidade, o crescimento e a viabilidade iniciais da semeadura bacteriana ao longo do tempo. Três desses métodos, o método de co-cultura direta (A)¹⁷, o m?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2