Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Resumo

Apresentamos aqui um método para obter imagens do intestino após ferimento induzido por laser. Ao expor o intestino do camundongo a um laser multifóton, a perda de uma única ou múltiplas criptas é induzida localmente. Ao obter imagens repetidas da área danificada ao longo de meses, a dinâmica em tempo real da recuperação intestinal é capturada.

Resumo

Investigar a recuperação intestinal in vivo é um desafio técnico primoroso. A falta de protocolos de imagem longitudinais impediu insights mais profundos sobre a dinâmica da escala celular e tecidual que orquestra a regeneração intestinal. Aqui, descrevemos um método de microscopia intravital que induz localmente dano tecidual em escala de cripta única e segue a resposta regenerativa do epitélio intestinal em camundongos vivos. Criptas únicas ou campos intestinais maiores foram ablados, por um laser infravermelho multifóton de alta intensidade, de forma controlada no tempo e no espaço. Imagens intravitais repetitivas subsequentes de longo prazo permitiram o rastreamento das áreas danificadas ao longo do tempo e permitiram o monitoramento da dinâmica das criptas durante a recuperação do tecido durante um período de várias semanas. Eventos de remodelamento de criptas, como fissão, fusão e desaparecimento de criptas, foram observados no tecido vizinho após dano induzido por laser. Este protocolo possibilita o estudo da dinâmica das criptas tanto em cenários homeostáticos quanto fisiopatológicos, como envelhecimento e iniciação tumoral.

Introdução

O revestimento epitelial do intestino é constantemente desafiado por ácidos gástricos, toxinas e microbiota que podem causar ruptura da barreira epitelial. A estrutura intestinal e a organização dos tecidos são especializadas para se auto-renovar e reparar danos constantemente. O epitélio de camada única do intestino delgado está organizado em unidades cript-vilosidades¹. Na homeostase, células-tronco intestinais Lgr5⁺ auto-renovadoras que residem na base da cripta dão origem a uma progênie diferenciada. As células-filhas diferenciadas viajam até a ponta do eixo das vilosidades de forma de correia transportadora, onde são eliminadas para que o revestimento intestinal seja reabastecido em 3-5 dias ^2,3. Em longo prazo, nem todas as células ^Lgr5+ contribuem igualmente para a renovação tecidual, pois isso também depende da capacidade das células de se moverem contra a correia transportadora em direção à base da cripta (isto é, movimento retrógrado)^4,5. De fato, após a ablação de células ^Lgr5+ por, por exemplo, radiação, as células progenitoras fora da base da cripta movem-se para a base para desdiferenciar e reabastecer o pool de células-tronco ^6,7,8.

A inflamação aguda pode causar a perda de células-tronco ^{Lgr5+ 9,10}. Além da perda de células-tronco, muitos fatores externos podem causar danos agudos ao epitélio na escala das criptas. Foi demonstrado que radiação, tratamentos químicos e antibióticos lesam criptas intestinais e vilosidades¹¹. Campos maiores de criptas e vilosidades podem ser afetados por infecções bacterianas, virais e parasitárias¹². O intestino possui uma notável capacidade de se recuperar de danos internos e externos na escala da cripta por fissão de criptas (uma divisão de uma cripta em duas)¹³. Após ferimentos, as criptas na área adjacente ao dano sofrem fissão para reabastecer os números das criptas. Esse fenômeno também ocorre, embora em menor grau, durante a homeostase^14,15. Para contrabalançar um potencial aumento no número de criptas durante a homeostase, as criptas também podem se fundir (fundir duas criptas em uma)^16,17. Não se sabe se a fusão de criptas também desempenha um papel no restabelecimento do número de criptas após ferimentos. Além disso, a dinâmica e os fatores regulatórios desse processo ainda precisam ser elucidados.

Modelos de lesão são indispensáveis para o estudo da regeneração tecidual in vivo. Vários modelos de lesão têm sido utilizados para estudar a regeneração do tecido intestinal. Estratégias experimentais anteriores empregaram altas doses de radiação para esgotar pools de células-tronco¹⁸ ou tratamento com dextran sulfato de sódio (DSS) para induzir colite crônica e aguda e perda de criptas em camundongos ^19,20. A ablação unicelular por meios genéticos ou ópticos tem sido utilizada para refinar o dano tecidual e considerada uma ferramenta atrativa para desvendar o papel das células-tronco e progenitoras ^21,22 e estudar a regeneração vascular²³. Além disso, um sistema de biópsia-lesão foi desenvolvido para induzir danos em campos maiores de várias criptas e vilosidades²⁴. É importante ressaltar que a resposta ao insulto lesivo pode variar ao longo do eixo proximal-distal do intestino, como relatado para a radiação, que causou mais danos no intestino delgado do que no cólon²⁵. Isso destaca a necessidade de métodos direcionados que controlem tanto a extensão do insulto prejudicial quanto sua localização no trato intestinal.

A extensão e a recuperação do dano têm sido convencionalmente avaliadas por meios estáticos, que fornecem informações limitadas sobre a dinâmica da recuperação tecidual. A microscopia intravital (MIV) abriu oportunidades únicas para quantificar o comportamento das células-tronco, o remodelamento epitelial e a regeneração em muitos órgãos 26,27,28,29,30 e forneceu informações impactantes sobre a biologia intestinal 4,5,21,31,32,33,34, ^35,36.

Aqui, descrevemos um método para causar dano intestinal definido espaço-temporal e capturar a recuperação do revestimento epitelial intestinal. Utilizamos dois fótons de ablação a laser para danificar criptas intestinais e acompanhar a resposta imediata da ferida e a recuperação a longo prazo por microscopia intravital repetitiva. Nosso protocolo permite mapear o remodelamento regenerativo da arquitetura do tecido intestinal em resposta ao dano tecidual local. A dinâmica das criptas, incluindo eventos de fissão e fusão, pode ser prontamente quantificada e rastreada ao longo do tempo. A aplicação da ablação a laser e de imagens intravitais repetitivas pode ser utilizada como uma plataforma para investigar a dinâmica em escala tecidual da arquitetura intestinal durante a homeostase e fisiopatologia, como o início do tumor.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovação do Animal Welfare Body (AWB) do Netherlands Cancer Institute (NKI).

OBS: Consulte o comitê de ética animal do instituto antes de realizar qualquer experimento animal.

1. Preparo para cirurgia e imagem intravital

1. Tratamentos pré-cirúrgicos
   1. Induzir camundongos K19-CreERT2³⁷ com 8-12 semanas de idade: Rosa26-mTmG 38 e Lgr5eGFP-IRES-CreERT2¹⁸: Rosa26-Confetti³⁹ camundongos injetando tamoxifeno dissolvido em óleo de girassol por via intraperitoneal 4-6 semanas antes da cirurgia (Figura 1).
   2. Aplicar analgesia. Injetar 200 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal) diluído em NaCl 0,9% por 30 g de ratinho por via subcutânea 30 minutos antes da cirurgia. Administrar carprofeno (0,067 mg/mL) em frasco contendo 125 mL de água potável autoclavada não acidificada 24 h antes da cirurgia. Alternativamente, administrar uma injeção de carprofeno por via subcutânea (5 mg/kg) 30 minutos antes do início da cirurgia.
2. Preparo para a cirurgia
   1. Introduzir ferramentas cirúrgicas estéreis autoclavadas no gabinete de risco biológico.
   2. Ligue a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura para 37 °C.
3. Preparação para exames de imagem intravitais
   1. Ligue a câmara de temperatura controlada do microscópio pelo menos 4 h antes da obtenção de imagens para permitir tempo suficiente para a estabilização da temperatura.
      NOTA: O tempo necessário pode variar dependendo da máquina utilizada.
   2. Mantenha a temperatura dentro da câmara climática estável a 37 °C.
   3. Ligue o microscópio de dois fótons, o scanner e o laser.
   4. Inicie o software de geração de imagens.
   5. Sintonize o comprimento de onda do laser para 960 nm e abra o obturador.

2. Cirurgia e imagem intravital

1. Exposição cirúrgica do intestino
   1. Anestesiar o rato com isoflurano a 2%-3% e colocá-lo numa almofada de aquecimento, coberta com um pano estéril. Verifique a profundidade da anestesia avaliando a frequência e a qualidade da respiração (uma respiração/segundo) e verificando o reflexo do mouse.
   2. Cubra os olhos do rato com pomada para os olhos.
   3. Injetar 200 μL de solução salina estéril pré-aquecida por via subcutânea.
   4. Faça a barba no abdômen e remova os pelos. Troque o pano estéril na área cirúrgica.
   5. Insira uma sonda retal para monitorar a temperatura do mouse.
      NOTA: A temperatura deve ser de aproximadamente 37 °C.
   6. Coloque um novo par de luvas estéreis.
   7. Limpar a área cirúrgica de forma circular com esfregaços alternados de solução antisséptica seguida de etanol 80% três vezes. Retire o excesso de etanol com um cotonete estéril.
      NOTA: É fundamental monitorar o mouse para hipotermia neste momento.
   8. Cubra o rato com um campo cirúrgico estéril.
   9. Verifique o reflexo do mouse.
   10. Faça uma incisão vertical de ~10 mm na linha média através da pele usando um bisturi estéril.
   11. Incise a linha alba usando tesoura para separar os músculos retos abdominais e abrir o abdômen.
   12. Encontre o ceco do rato usando cotonetes estéreis embebidos em soro fisiológico pré-aquecido estéril para usá-lo como ponto de referência.
   13. Faça um pequeno corte em um pedaço de gaze estéril, molhe-o em soro fisiológico estéril pré-aquecido e coloque-o acima da incisão.
   14. Retire o intestino com cotonetes estéreis embebidos em soro fisiológico estéril pré-aquecido. Mantenha o intestino hidratado adicionando soro fisiológico pré-aquecido estéril.
   15. Coloque uma câmara de imagem estéril personalizada ao lado do mouse.
   16. Transfira o mouse para a caixa de imagem estéril pré-aquecida.
   17. Coloque o intestino no vidro estéril da caixa de imagem. Coloque a cabeça do mouse dentro do tubo de inalação da caixa de imagem, como mostra a Figura 1.
   18. Se necessário, prenda o mouse com filme e fita flexíveis estéreis.
   19. Coloque a caixa de imagem que contém o rato na câmara do microscópio.
2. Imagem intravital
   1. Monitore o mouse durante a aquisição de imagens verificando a frequência e a profundidade da respiração e da temperatura por meio de uma sonda retal a cada 15 min. A porcentagem de isoflurano deve ser mantida entre 1%-2%. Ajuste se necessário.
   2. Encontre uma região no intestino usando a ocular do microscópio.
   3. Obter uma visão de campo amplo da região de interesse usando a câmera interna do microscópio, como pode ser visto na Figura 2A.
   4. Obtenha imagens da região de interesse usando o laser de 960 nm do microscópio multifóton. Ajustar a potência e o comprimento de onda do laser de acordo com os fluoróforos utilizados no experimento.
   5. Adquira uma pilha z de 10-20 passos de 3 μm da região de interesse.
3. Ablação a laser
   1. Escolha uma única posição ou várias posições do bloco fotografado anteriormente.
   2. Use a função de calibração de ponto de alvejamento no software de imagem com zoom de 32 e resolução de 124 x 124 pixels com velocidade de varredura de 400 Hz, usando a propriedade de varredura bidirecional por 3-10 s, dependendo do tamanho do dano pretendido. O início de danos na área da cripta pode ser reconhecido por um aumento na autofluorescência nos canais verde e vermelho.
   3. Repita as duas etapas anteriores para várias regiões no mesmo mouse.
   4. Após a ablação, adquira z-stacks das regiões danificadas para confirmar a localização e a extensão do dano.
4. Fechamento do sítio cirúrgico
   1. Coloque o rato, ainda sob anestesia, numa zona de sutura estéril.
   2. Insira o intestino exposto de volta no abdômen usando cotonetes estéreis embebidos em soro fisiológico estéril pré-aquecido.
   3. Sutura da linha alba realizando sutura simples contínua com fio absorvível 5-0. Fechar as extremidades da sutura com nós cirúrgicos.
   4. Repita o mesmo passo com a camada de pele.
   5. Desligue a estação de isoflurano e limpe e esterilize a caixa de imagem e o inlay.
   6. Limpe as ferramentas de cirurgia com o limpador de instrumentos cirúrgicos, o limpador enzimático e o lubrificante de instrumentos cirúrgicos. Quando seco, esterilizar os instrumentos cirúrgicos juntamente com a caixa cirúrgica na autoclave.
5. Cuidados pós-cirúrgicos
   1. Deixe o rato recuperar da cirurgia enquanto a gaiola é colocada na almofada de aquecimento durante ~1 h.
      NOTA: Coloque o mouse com outros companheiros de gaiola, se possível. A moradia solitária não é necessária para a recuperação.
   2. Verifique a temperatura do mouse a cada 15 min durante a recuperação.
   3. Injetar 200 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal) diluído em NaCl 0,9% por 30 g de camundongo por via subcutânea 6-12 h após a cirurgia.
   4. Administrar carprofeno (0,067 mg/mL) em frasco contendo 125 mL de água potável autoclavada não acidificada por 72 h pós-operatório.
   5. Pese o rato e monitorize o bem-estar todos os dias durante 1 semana pós-cirurgia.

3. Cirurgia de repetição e imagem intravital

1. Cirurgia
   1. No segundo momento (pelo menos 1 semana após a primeira sessão de imagem), repita as etapas 1.1.2, 1.2, 1.3 e 2.1.
2. Imagem intravital
   1. Repita as etapas 2.2.1-2.2.3.
   2. Use o padrão dos vasos sanguíneos para encontrar as mesmas regiões de interesse fotografadas no primeiro ponto de tempo.
   3. Repita as etapas 2.2.4 e 2.2.5.
3. Fechamento do sítio cirúrgico
   1. Repita a etapa 2.4.1.
   2. Se o mouse não deve ser fotografado em outro ponto de tempo, sacrifique o mouse realizando deslocamento cervical sob anestesia terminal. Caso contrário, continue com a próxima etapa.
      NOTA: De acordo com as diretrizes da Diretiva da UE 2010/63/UE, apêndice IV, a luxação cervical é um método aceitável.
   3. Repita as etapas 2.4.2-2.4.6.
4. Cuidados pós-cirúrgicos
   1. Repita as etapas 2.5.1-2.5.5.

Resultados

Para demonstrar o tipo de resultados que podem ser obtidos com o método de ablação a laser combinado com imagens intravitais, realizamos um experimento como mostrado na Figura 1. Primeiro, injetamos K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) e Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Camundongos Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) com tamoxifeno para marcar estocásticos as células com uma das cores de confete (ou proteína fluorescente verde [GFP] no caso de camundongos mTmG). O K19-cre induz o rastreamento de linhagens a partir de todas as células epiteliais, enquanto o Lgr5-cre induz o rastreamento a partir de células-tronco apenas ^8,18,37. A injeção de tamoxifeno foi administrada 4-6 semanas antes da cirurgia e da primeira sessão de imagem para obtenção de criptas nas quais todas as células são monoclonais para uma determinada cor. A identificação robusta das mesmas regiões de tecido ao longo de várias semanas é essencial para rastrear o destino das mesmas criptas ao longo do tempo. Características arquitetônicas teciduais inerentes, como a vasculatura, podem ser usadas como pontos de referência teciduais confiáveis, e foram aqui registradas com a câmera interna do microscópio. Além disso, rotular uma pequena fração de criptas com (pelo menos duas) cores diferentes ajudou a reconhecer as mesmas criptas em cada sessão de imagem e acompanhar seu comportamento durante o processo regenerativo após danos causados pelo laser. Ao expor cirurgicamente o intestino do camundongo e adquirir imagens fluorescentes e de câmera da região de interesse (Figura 2A), ajustes de ponto de alvejamento do laser multifóton podem ser usados para abater uma ou mais criptas (Figura 2B,C). O início do dano pode ser reconhecido por um aumento na autofluorescência nos canais verde e vermelho. Para estudar a dinâmica da recuperação das criptas, a cirurgia e o procedimento de imagem foram repetidos semanas/meses após a primeira sessão de imagem e estruturas inerentes ao tecido (vasculatura e padrões de criptas clonalmente marcadas) foram usadas como pontos de referência para encontrar exatamente o mesmo local da lesão (Figura 2). Quando este método foi aplicado em camundongos Lgr5Cre-Confetti, onde Lgr5-eGFP é expresso de forma irregular, mudanças no número e na forma das criptas após o dano induzido pelo laser puderam ser capturadas (Figura 3). Enquanto algumas regiões não apresentaram alterações no número e na estrutura das criptas (Figura 3B), outras regiões apresentaram extenso remodelamento das criptas, como observado no número de eventos de fissão e fusão das criptas (Figura 3C) e na perda das criptas 2 semanas após a lesão induzida pelo laser (Figura 3D). Introduzindo diferentes tamanhos de dano e quantificando os eventos de fissão, fusão e desaparecimento após a ablação, como no exemplo mostrado na (Figura 3E), a dinâmica da regeneração induzida por lesão pode ser mapeada em diferentes modelos de camundongos.

Figura 1: Representação esquemática do arranjo experimental. A marcação in vivo de células intestinais é obtida pela injeção intraperitoneal de tamoxifeno em modelos de camundongos geneticamente modificados para induzir recombinação mediada por Cre em criptas intestinais. Após dias ou semanas (quando as criptas são monoclonais para uma determinada cor), o intestino é exposto cirurgicamente e submetido à ablação a laser usando um microscópio multifóton com uma câmara de temperatura controlada. A extensão do dano da cripta é caracterizada imediatamente após a ablação e o mouse é permitido se recuperar do procedimento. A exposição cirúrgica repetida e a MIV são usadas para monitorar a recuperação intestinal ao longo do tempo. O padrão e a distribuição da vasculatura sanguínea e criptas de cores diferentes são usados para encontrar de volta as mesmas regiões semanas ou meses após a ablação. O remodelamento da cripta (por exemplo, fissão ou fusão) pode ser observado no local do dano semanas após a ablação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem longitudinal da regeneração tecidual após dano induzido por laser no intestino. Quando o intestino é posicionado exatamente da mesma maneira, os vasos sanguíneos do intestino podem ser usados como um mapa para encontrar e obter imagens exatamente das mesmas regiões. (A) Imagens de visão geral da câmera do intestino. As linhas brancas tracejadas representam o padrão da vasculatura vizinha ao local do dano (caixa branca), usada como um ponto de referência para encontrar a mesma região ablativa a laser em outro ponto de tempo. As duas imagens inferiores mostram a visualização ampliada da caixa branca. A seta mostra o local exato da ablação a laser no dia 1 e 1 mês depois. (B) Imagens fluorescentes de um único dano de cripta capturadas por microscópio multifóton. A seta na caixa azul mostra o local do dano no dia 1 e 1 mês depois. (C) Imagens fluorescentes de um campo danificado de criptas. As setas na caixa azul marcam a região do dano no dia 1 e 1 mês depois. Barras de escala: 1 mm (A, topo); 0,25 mm (A, fundo); 200 μm (visão geral B e C); e 50 μm (imagens ampliadas B e C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem intravital do destino das criptas após ablação a laser. (A) Usando o modelo de Confete, criptas rotuladas com cores diferentes podem ser seguidas ao longo do tempo para mapear a dinâmica de recuperação. A seta branca representa o local da ablação a laser. A caixa amarela representa uma região vizinha (<100 μm do local do dano), enquanto as caixas azul e roxa representam regiões distantes (>100 μm) da região ablada-laser. Diferentes modos de regeneração são observados. (B) Algumas regiões permanecem inalteradas como na caixa roxa. (C) Outras regiões exibem remodelamento de criptas na forma de fissão ou fusão de criptas; As linhas brancas tracejadas e as setas retratam eventos de fissão de criptas e as linhas tracejadas e setas laranjas retratam eventos de fusão de criptas. (D) Em algumas regiões, observa-se o desaparecimento da cripta, como na caixa amarela onde a cripta destacada com uma linha tracejada laranja desapareceu. (E) Um exemplo de quantificação mostrando o número de eventos de remodelação de criptas observados nas áreas vizinhas (ou seja, menos de 100 μm) e distantes (ou seja, mais de 100 μm) do local do dano. Barras de escala: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo combina ablação microscópica a laser e microscopia intravital longitudinal para acompanhar a regeneração intestinal, desde a resposta precoce ao dano até o remodelamento tecidual a longo prazo. A técnica foi estabelecida em estrita adesão às considerações éticas para induzir e obter imagens microscópicas de ablação a laser, e quando seguida com precisão manterá o bem-estar animal. Durante a cirurgia, é importante certificar-se de que a integridade do intestino está bem preservada. Isso pode ser conseguido manuseando suavemente o tecido com cotonetes úmidos estéreis, o que evita sangramento ou ressecamento do tecido. A extensão do dano microscópico induzido pelo laser também deve ser cuidadosamente avaliada por meio de imagens das diferentes camadas intestinais da área após a ablação a laser. Caso o pesquisador deseje adequar a frequência das etapas experimentais descritas neste protocolo, o comitê de ética animal do instituto deve ser consultado antes do experimento para estabelecer a consequência sobre o bem-estar.

A microscopia intravital repetitiva permite monitorar a recuperação tecidual no mesmo mouse ao longo do tempo. A exposição cirúrgica repetida do intestino concede prontamente acesso óptico a todo o trato intestinal. Características teciduais inerentes, como a vasculatura, servem como pontos de referência para identificar as mesmas regiões intestinais em cada sessão de imagem. Assim, uma mesma região de tecido pode ser imageada ao longo de várias semanas, o que permite quantificar a regeneração tecidual a longo prazo na mesma área intestinal no mesmo camundongo. O controle espaço-temporal oferecido pelo método combinado de cirurgia e imagem traz a vantagem de que um mesmo órgão pode ser fotografado em condições homeostáticas e regeneradoras em um mesmo camundongo, o que contrasta com modelos anteriores de lesão de todo o órgão, onde amostras controles e regeneradoras originaram-se de camundongos diferentes 11,12,18,19,20 . Assim, nosso ambiente experimental minimiza o número necessário de animais para o experimento e reduz a variação intra-animal.

A solução de problemas do protocolo deve começar com uma revisão da técnica de manuseio do mouse e do intestino e um controle do equipamento e das configurações de microscopia. Há muitas etapas críticas neste protocolo que requerem atenção extra. Primeiro, para garantir o bem-estar animal e a alta qualidade contínua dos dados, todo o trabalho precisa ser realizado em um ambiente estéril limpo usando técnica asséptica, e a temperatura do camundongo deve ser mantida durante a cirurgia e cada sessão de imagem. Manter o tecido hidratado com soro fisiológico estéril e pré-aquecido durante a aquisição de imagens é essencial e previne a fibrose tecidual.

Para garantir que o experimento seja realizado de forma reprodutível, é importante alinhar os lasers antes do uso para uma aquisição ótima e medir a potência do laser multifóton no início de cada sessão. Parâmetros como o tipo de objetivo, magnificação, tempo de permanência, potência do laser e comprimento de onda têm influência na extensão da ablação microscópica a laser e devem ser considerados. Neste estudo, tanto a ablação a laser quanto as imagens são conduzidas com uma potência do laser de 1,2 W (fora da lente) em um comprimento de onda de 960 nm através de uma objetiva Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER. A alteração do comprimento de onda ou das propriedades de varredura óptica afeta a extensão do dano microscópico. Um comprimento de onda mais baixo (como 840 nm) se traduz em fótons de maior energia e muitas vezes em uma saída mais alta do laser, e pode aumentar o dano microscópico. Um zoom maior resulta em mais energia por região e, portanto, menos tempo para abater criptas e vice-versa. O tempo de permanência do pixel também pode ser aumentado ou diminuído para alterar a velocidade da ablação e a extensão do dano. Quando o tecido imageado não é estável (por exemplo, devido a movimentos peristálticos), a ablação precisa ser realizada rapidamente. Para isso, a velocidade de ablação deve ser otimizada, por exemplo, aumentando o zoom e/ou a saída do laser.

Encontrar a mesma região intestinal em várias sessões de imagem é outra etapa crítica que precisa ser executada adequadamente para garantir o sucesso do experimento. Para fazer isso, o intestino precisa ser posicionado exatamente da mesma maneira em todos os pontos de tempo. Recomendamos sempre usar o ceco como ponto de referência para encontrar as mesmas regiões no intestino delgado e grosso. Esticar suavemente o tecido de interesse com cotonetes garante que a região de interesse esteja ao alcance da distância de trabalho objetiva e maximiza o número de regiões que podem ser rastreadas. Além disso, recomendamos sempre aplacar e obter imagens de várias posições microscópicas em cada camundongo para levar em conta as regiões que podem não estar localizadas de volta em uma sessão de imagem posterior. Se as regiões não puderem ser encontradas, mesmo que o posicionamento do intestino esteja correto, pode ajudar a reposicionar o rato e mudar a orientação da área exposta. Rastrear criptas ao longo do tempo pode ser complicado para experimentos onde campos intestinais maiores de várias criptas adjacentes são ablados. Tais insultos lesivos podem evocar remodelamento tecidual além da monocamada epitelial, o que pode culminar na modificação dos pontos de referência teciduais utilizados para rastreamento da região ao longo do tempo. Escolher pontos de referência a uma distância suficiente do local danificado e capturar campos de visão maiores que excedam a área danificada em várias centenas de micrômetros aumenta a chance de experimentos bem-sucedidos a longo prazo. Além do posicionamento incorreto do intestino no palco do microscópio, os movimentos peristálticos do trato gastrointestinal podem interferir na imagem. Esse problema pode ser amenizado de duas maneiras. Se a frequência dos movimentos não for muito alta, o processo pode ser repetido na mesma região com aumento do tempo de exposição. Alternativamente, quantidades maiores de anestesia podem ser usadas para diminuir o peristaltismo. Recomendamos limitar doses mais elevadas de isoflurano a ajustes curtos. Em conjunto, as sessões de imagem devem ser mantidas o mais curtas possível, idealmente abaixo de 3 h, para garantir uma recuperação rápida.

A abordagem combinada de ablação a laser e microscopia intravital longitudinal apresenta várias vantagens quando comparada com outros modelos de dano. Modelos anteriores de dano (químico) não tinham a capacidade de confinar localmente o insulto lesivo 6,11,12,19,20. A ablação a laser supera essa deficiência restringindo o dano a uma região de interesse definida. Isso permite que os pesquisadores controlem a localização da lesão, bem como a extensão do dano. A gravidade do dano pode ser modulada para criptas ablatas ou campos intestinais microscópicos inteiros para informar sobre respostas regenerativas na escala de criptas. Além do controle espacial, a ablação a laser também permite cronometrar com precisão o início do dano, superando a precisão^{de modelos} prévios de fármacos, químicos e infecções9,10,11,12,19,20. Nosso protocolo expande estudos anteriores que utilizaram a termoablação induzida por laser como método para induzir dano localizado no intestino^21,23. Modelos prévios de dano induzido por laser capturaram imagens de áreas locais no intestino delgado²¹ ou da superfície luminal do cólon distal²³. A abordagem combinada de cirurgia e ablação a laser permite visualizar o epitélio intestinal (criptas em particular) em alta resolução, além de realizar ablação a laser e acompanhamento da recuperação tecidual em qualquer posição do intestino delgado, ceco e cólon proximal. Ele captura a recuperação das mesmas regiões intestinais ao longo do tempo, permitindo visualizar diferentes camadas do intestino (mucosa, submucosa, muscular e serosa) de acordo com a configuração experimental. Nossa técnica é principalmente adaptada para imagens repetidas a longo prazo por um período de várias semanas/meses. Para estudar a dinâmica de recuperação de curto prazo de criptas (por exemplo, por vários dias consecutivos após danos), a abordagem de ablação a laser descrita aqui pode ser combinada com janelas de imagem intravitais^27,28,40.

Este protocolo pode ser utilizado para uma infinidade de aplicações de pesquisa de diversas áreas científicas que abrangem regeneração, imunologia e pesquisa de câncer. Imagens longitudinais da regeneração intestinal lançam luz sobre a dinâmica celular que preserva a integridade epitelial e a função de barreira, permite a defesa do hospedeiro contra patógenos na luz intestinal e que fundamenta a depuração e disseminação de mutações oncogênicas. Cada pergunta científica lançará demandas únicas sobre a extensão dos danos induzidos pelo laser e a duração das imagens. Camundongos repórteres fluorescentes e corantes injetados podem expandir e refinar drasticamente os dados que podem ser adquiridos, permitindo a visualização de qualquer célula e estrutura de interesse. Por exemplo, um camundongo Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti pode ser usado para visualizar progênies de células-tronco, enquanto o repórter Rosa26-mTmG informa sobre a arquitetura do tecido. Juntos, esses recentes avanços tecnológicos tornam a experimentação intestinal intravital uma ferramenta lucrativa para avançar nossa compreensão da biologia intestinal e das doenças.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia induction box	Veterinary Technics
Autoclave	Certoclav
Betadine	Mylan	202809
Diaper (underpad)	Absorin comfort
Dumont forceps	Fine Scientific Tools	11255-20 or 11272-40	Inox, style #55, used to hold the peritoneum
Enzymatic instrument cleaner	Roboz	EC-1000
Ethanol 80%	homemade	NA
Eye ointment	Duratears Z (Alcon)	288/28282-6
Fine Scissors Straight 9 cm	Fine Scientific Tools	14060-09	Used to cut skin and peritoneum of the mouse
Gauze 5 cmX5 cm	Cutisoft (Bsn medical)	45847-00
Graefe Forceps Curved Serrated	Fine Scientific Tools	11051-10	Used to hold the skin
Hartman Hemostat Straight	Fine Scientific Tools	13002-10	Used for suturing
Heating pad	Comfort	T5-5000
Imaging box	Custom made
Incision film	Nobafilm	172215
Inverted multi-photon microscope with automated stage	Leica Microsystems	NA
Isoflurane (vetflurane)	Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands	305788
Isoflurane vaporizer	Penlon sigma delta
Micropore paper tape	Micropore
NaCl 0.9%	Braun		Other brands available
Needle 25G	BD	300600
Paper tape tesa	Tesa	NA
Parafilm	Bemis	PM-994	semi-transparent tape
Razor blades	Supermax stainless steel		Other brands available
Rectal probe	Kent Scientific	20250-91
Rimadyl Cattle (carprofen)	Zoetis B.V	Registration# REG NL 10130
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11	Used to cut gauze
Surgical instrument cleaner	Roboz	IC-1000
Surgical instrument lubricant	Roboz	IL-1000
Syringes (1 ml)	BD	303172	Other brands available
Tamoxifen	Sigma	T5648
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride)	Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare	Registration# RVG 08725
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle	Ethicon	V292ZH
VirkonS	Bio-services		antiseptic solution
Wooden cotton swab (sterile)	Klinion	531530	Other brands available