Avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer

Resumo

Este protocolo apresenta um conjunto de experimentos adotados para a avaliação de peptídeos anticâncer fotocomutáveis, que podem ser utilizados na triagem pré-clínica destes compostos. Isso inclui a avaliação da citotoxicidade em culturas de células 2D e 3D, a avaliação da eficiência de fotoisomerização ex vivo (tecido modelo) e a eficácia in vivo .

Resumo

Compostos biologicamente ativos fotocontrolados são uma classe emergente de candidatos a drogas "inteligentes". Eles fornecem segurança adicional na quimioterapia sistêmica devido à sua ativação espaço-temporal precisa, direcionando uma luz benigna não ionizável para um local específico dentro do corpo do paciente. Este trabalho apresenta um conjunto de métodos para avaliar a potência in vitro e a eficiência ex vivo da fotoativação de compostos biologicamente ativos fotocontrolados, bem como a eficácia in vivo nos estágios iniciais do desenvolvimento de fármacos. A metodologia é aplicada a peptídeos citotóxicos anticâncer, ou seja, os análogos contendo diarileteno de um antibiótico conhecido, a gramicidina S. Os experimentos são realizados usando culturas de células 2D (células aderentes) e 3D (esferoides) de uma linhagem de células cancerosas (Lewis lung carcinoma, LLC), substitutos de tecidos vivos (carne de porco picada) e um modelo de câncer aloenxerto (LLC subcutâneo) em camundongos imunocompetentes. A seleção dos compostos mais eficazes e a estimativa de janelas fototerapêuticas realísticas são realizadas através de microscopia de fluorescência automatizada. A eficiência de fotoativação em diferentes regimes de iluminação é determinada em diferentes profundidades em um tecido modelo, e a dose ótima de luz é aplicada no experimento terapêutico final in vivo .

Introdução

Compostos biologicamente ativos fotocontrolados têm emergido nas últimas décadas como um componente promissor de quimioterapias seguras para doenças humanas e especificamente para erradicar tumores sólidos^malignos1. Estes compostos contêm fragmentos reversivelmente fotoisorizáveis (fotointerruptores moleculares) e podem alternar entre fotoisômeros inativos e ativos após irradiação com luz de diferentes comprimentos de onda.

Em comparação com seus análogos não fotocontroláveis, os medicamentos fotocontrolados podem ser mais seguros porque podem ser introduzidos sistemicamente no corpo do paciente em formas menos ativas e essencialmente não tóxicas, e são ativados pela luz apenas quando necessário, como em tumores, úlceras e feridas. Embora múltiplas demonstrações empolgantes desses protótipos de fármacos moleculares possam ser encontradas em trabalhos acadêmicos recentes2,3,4,5,6,7, o campo da fotofarmacologia clínica - uma aplicação de combinações aprovadas^, fármaco/dispositivo médico/doença - não existe. A fotofarmacologia ainda está em fase de descoberta de fármacos, e estudos pré-clínicos sistemáticos são desconhecidos.

Apenas muito recentemente demonstramos a vantagem de segurança in vivo para alguns peptídeos anticâncer fotocontrolados, a saber, os análogos do antibiótico peptídeo gramicidina S⁸. Esses derivados fotocontrolados contêm um fotointerruptor de diarileteno (DAE), que sofre transformações fotoinduzidas reversíveis entre as chamadas fotoformas "anel-aberto" gerado pela luz vermelha e "anel-fechado" gerado pelos raios UV (ilustrado na Figura 1 para um dos derivados, o composto LMB002).

Figura 1: Peptídeo citotóxico fotocontrolado LMB002 e sua fotoisomerização. O fragmento de diarileteno é mostrado em vermelho. Abreviação: DAE = diarylethene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A busca de acertos e a otimização hit-to-lead geralmente requerem a triagem in vitro e in vivo de bibliotecas de compostos apropriadas ^9,10. Aqui, demonstramos uma metodologia adequada para a triagem sistemática de alta produtividade da citotoxicidade de compostos fotocontrolados. Também determinamos a eficiência da fotoisomerização, estimamos a dose de luz nos tecidos modelo e avaliamos a eficácia in vivo dos candidatos com melhor desempenho. A abordagem está de acordo com as considerações de bioética e cuidados com os animais.

Neste trabalho, métodos pré-clínicos tradicionais são modificados para evitar a fotoisomerização não controlada dos compostos testados. O objetivo geral da aplicação desses métodos modificados aqui é desenvolver uma estratégia geral que seja direta e rápida e produza dados estatisticamente significativos para comparar de forma confiável as atividades in vitro e racionalizar os testes de eficácia in vivo de compostos fotocomutáveis para identificação e desenvolvimento de chumbo.

A estratégia consiste em três etapas consecutivas. A primeira etapa envolve a determinação de CI 50 (viabilidade celular aparente de₅₀ %) em diluições seriadas para fotoformas ativas e inativas de compostos biologicamente ativos fotocontrolados selecionados usando culturas de células bidimensionais (2D, monocamada) e tridimensionais (3D, esferoide) e microscopia de fluorescência automatizada confocal de alto rendimento. Janelas fototerapêuticas são comparadas em relação à diferença de CI₅₀ entre as duas fotoformas, e os candidatos com melhor desempenho são selecionados. Não há vantagem específica na avaliação da toxicidade por microscopia automatizada e outras plataformas de triagem de citotoxicidade (ensaios)¹¹; Modelos tumorais celulares mais^complexos12 poderiam ser facilmente implementados nessa fase.

Para os compostos selecionados na etapa 1, o segundo passo é estimar realisticamente sua eficiência de fotocomutação dentro dos tecidos em função da profundidade da superfície do tecido irradiado, quantificando a eficiência de fotocomutação das fotoformas menos ativas em um substituto de tecido usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) detectada por UV de extratos de amostras irradiadas. In vivo , a eficiência da fototroca poderia ser estudada, mas propomos usar um substituto de tecido simples - carne de porco picada. Testamos a validade dessa abordagem. Medimos a conversão de nossos compostos fotocomutáveis in vivo em um modelo de câncer de camundongos e observamos aproximadamente a mesma fotoconversão em uma profundidade medida em experimentos anteriores com camundongos⁸. Qualquer tecido artificial alternativo adequado¹³, tecido/órgão bioimpresso 3D¹⁴, materiais de biópsia ou outro material animal isento poderia ser usado. No entanto, essa configuração é um bom compromisso, pois é econômica, rápida e ética.

O terceiro passo é a determinação da eficácia anticâncer in vivo em um modelo de câncer murino. Os compostos que demonstram características superiores nos experimentos in vitro e fotocomutação eficiente a uma profundidade de pelo menos 1-1,5 cm nos tecidos modelo são selecionados para este experimento.

Este protocolo pode ser aplicado a compostos que possuam diferentes tipos de fotointerruptores, desde que suas fotoformas (ou seus estados fotoestacionários, PSS) sejam estáveis por um tempo razoável (alguns dias ou mais). Para ilustração, um LMB002 derivado do DAE descrito anteriormente é usado¹⁵. Os fotofórmios LMB002 são termicamente estáveis e podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos um ano sem degradação substancial. As células do carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) são escolhidas para esta demonstração in vitro e in vivo, mas nenhuma restrição é imposta ao tipo celular. As células LLC são aderentes, prontamente cultiváveis em 3D e usadas para gerar tumoróides (como descrito na referência¹⁶). In vivo As células LLC são usadas para modelar processos metastáticos e podem facilmente gerar tumores sólidos em camundongos imunocompetentes após injeção subcutânea. Essa metodologia in vivo pode ser aplicada universalmente a outros modelos de câncer^17,18. A implementação detalhada desta estratégia é descrita a seguir.

Protocolo

Os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram realizados seguindo as regulamentações locais e internacionais para a realização de projetos de pesquisa envolvendo animais de laboratório (Lei da Ucrânia "Sobre a Proteção dos Animais contra a Crueldade", Convenção Europeia para a Proteção de Animais Vertebrados Utilizados para Fins Experimentais e Outros Fins Científicos (Convenção Europeia, Estrasburgo, 1986), Diretiva 2010/63/UE relativa à Proteção dos Animais Utilizados para Fins Científicos). Este estudo é aprovado pela Comissão de Bioética da empresa Bienta. Camundongos C57BL/6NCrl (fêmeas adultas pesando aproximadamente 20 g cada) foram utilizados nesses experimentos. Materiais, reagentes e equipamentos específicos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Avaliação do IC₅₀ para LMB002 ("formas ring-closed" e "ring-open") usando culturas de células 2D e 3D LLC

1. Preparação de tampões e soluções-estoque dos compostos
   Observação : preparar buffers usando procedimentos padrão. Alternativamente, use soluções disponíveis comercialmente.
   1. Preparar 10x solução salina tamponada com fosfato (PBS) adicionando 14,2 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO₄, 80 g de NaCl e₂g de KCl a 1 L de água destilada. Autoclave preparada 10x PBS e diluir em 1x solução adicionando 100 mL de solução 10x a 900 mL de água destilada. Em seguida, conservar a solução a 4 °C.
   2. Preparar o PBS (DPBS) da Dulbecco adicionando 4,78 g de pó de DPBS a 1 L de água destilada. Agite a solução até que todo o sólido se dissolva, verifique o pH usando um medidor de pH e ajuste-o adicionando 1 M de NaOH ou 1 M de HCl (pH 7,3-7,4). Após atingir o pH desejável, filtrar o meio através de um filtro a vácuo de 0,22 μm em um gabinete estéril. Conservar a 4 °C.
   3. Preparar 1 solução tampão do ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfónico (HEPES) M adicionando 238,3 g de HEPES a 1 L de água destilada. Ajustar o pH da solução com NaOH 1 M até pH 7,5. Filtrar através de um filtro a vácuo de 0,22 μm num gabinete estéril. Conservar a 4 °C.
   4. Preparar 1x solução de tripsina-EDTA (EDTA = ácido etilenodiaminotetracético) diluindo 10x solução. Para isso, adicione 5 mL de 10x Tripsina-EDTA a 45 mL de solução 1x PBS em um tubo estéril de 50 mL. Conservar a 4 °C.
   5. Prepare o Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) básico adicionando 13,4 g de DMEM em pó com alto teor de glicose e 3,7 g de Na₂CO₃ a 1 L de água destilada em um cilindro de medição com uma haste de agitação magnética colocada em uma placa de agitação. Agite a solução até que todo o sólido se dissolva, verifique o pH usando um medidor de pH e ajuste-o adicionando 1 M de NaOH ou 1 M de HCl (pH 7,3-7,4). Depois de atingir o pH desejável, filtrar o meio através de um filtro a vácuo de 0,22 μm num armário estéril e conservar a 4 °C.
   6. Preparar o meio completo DMEM adicionando 100 mL de soro fetal bovino (FBS), 10 mL de solução de penicilina-estreptomicina, 10 mL de solução de L-glutamina e 10 mL de tampão HEPES 1 M a 900 mL de DMEM básico. Conservar a 4 °C.
   7. Preparar soluções-estoque para os compostos de teste.
      1. Para cada composto, pesar dois lotes de 5,12 mg (por exemplo, LMB002) no fotofórmio fechado em anel em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (um com paredes transparentes e outro preto não transparente). Pesar 2,28 mg de controle positivo (por exemplo, gramicidina S) em um tubo de parede extratransparente. Adicionar 100 μL de DMSO puro a cada amostra e vórtice durante 30 s.
      2. Fotoisomerizar a solução-mãe (LMB002) no tubo de parede transparente da forma "anel-fechado" para a forma "anel-aberto" irradiando a solução com laser de 660 nm (densidade de potência de luz 0,6 W/cm²) com vórtice para garantir uma mistura completa. Continue até que a cor mude visivelmente de roxo escuro para marrom claro. Proteja da luz usando papel alumínio.
2. Experimento de cultura celular 2D - semeadura das células (dia 1)
   1. Transferir 10 mL do meio DMEM completo do frasco T-75 com cultura de células LLC para um tubo estéril de 15 mL. Aspirar o meio que sobrou com uma bomba de vácuo.
   2. Lavar a cultura celular com 5 mL de 1x DPBS e aspirar a solução com uma bomba de vácuo.
   3. Cobrir as células com 3 ml de solução de tripsina-EDTA a 1x e incubar o balão durante 2-3 minutos a 37 °C numa atmosfera de CO₂ a 5%.
   4. Interromper a ação da tripsina adicionando 6 mL do meio DMEM (previamente transferido para um tubo estéril) ao frasco de cultura celular contendo 1x solução de tripsina-EDTA e pipetando a suspensão várias vezes para lavar as células das paredes do frasco de cultura celular.
   5. Transferir a suspensão para um tubo de 15 mL e centrifugar a 200 × g por 4 min. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante com uma bomba de vácuo. Evite tocar o pellet de célula na parte inferior do tubo.
   6. Ressuspender as células adicionando 2 mL de meio completo de DMEM fresco e pipetando várias vezes.
   7. Contar as células por amostragem de cerca de 15 μL da suspensão em um tubo de 0,5 mL, adicionando 15 μL de azul de tripano a 0,4% e transferindo a mistura obtida para uma câmara de contagem celular.
   8. Após a contagem, preparar 25 mL da suspensão celular por ponto de tempo. Semear 5.000-10.000 (8.000 em média) células/poço LLC em 200 μL de DMEM nos 60 poços centrais de uma placa de 96 poços com fundo claro e paredes pretas não transparentes. Preencha os 36 poços restantes com DMEM puro.
   9. Colocar as placas numa incubadora de cultura celular durante a noite a 37 °C e 5% de CO2. Use tampas de placa de plástico por baixo para evitar o aquecimento irregular da placa inferior.
3. Experimento de cultura de células 2D - adição dos compostos (dia 2)
   1. Monitorar as células por microscopia de luz nas placas até que as células tenham atingido 70%-80% de confluência.
   2. Aspirar o meio dos poços com uma bomba de vácuo em um gabinete estéril. Adicionar 100 μL do meio DMEM fresco pré-aquecido e colocar as placas numa incubadora de cultura celular.
   3. Preparar diluições seriadas dos compostos de ensaio e controlo positivo em placas transparentes autoclavadas de polipropileno. Faça as seguintes soluções para medições de pontos de tempo individuais:
      NOTA: Comece com os estoques em DMSO e dilua com DMEM, mas não exceda 1% v/v de DMSO na concentração final mais alta.
      1. Para obter uma solução de 128 μM de gramicidina S, adicionar 1,3 μL de solução-mãe de 20 mM a 198,7 μL de DMEM.
      2. Para obter uma solução de 256 μM de LMB002, forma "ring-open", adicione 1,3 μL de solução de 40 mM a 198,7 μL de DMEM.
      3. Para obter uma solução de 512 μM de LMB002, forma "anel-fechada", adicionar 2,6 μL de solução-mãe de 40 mM a 197,4 μL de DMEM.
   4. Realizar três repetições adicionais para obter quatro séries de cada ponto de concentração. Prepare uma série de diluição dupla aspirando 100 μL de cada poço de partida, transferindo para um poço com 100 μL de DMEM e misturando completamente.
      NOTA: Trabalhar com compostos fotocomutáveis requer ajuste de iluminação para evitar a fotoisomerização traseira. Recomenda-se apagar a luz em armários estéreis.
   5. Obter as concentrações finais dos compostos em poços (5-150 μM) transferindo 100 μL das soluções preparadas cada vez em 56 poços com 100 μL de DMEM previamente adicionado. Adicionar 100 μL de DMEM cada vez em quatro poços para servir como controle negativo.
   6. Cubra as placas com folha de alumínio ou tampa protetora plástica não transparente para evitar a troca descontrolada de fotos. Colocar as placas em uma incubadora de cultura celular a 37 °C (usando tampas de placas de plástico extra) sob o tempo de incubação escolhido (10 min, 60 min, 24 h ou 72 h).
4. Experimento de cultura de células 2D - coloração e imagem (dias 2-5)
   1. Após a incubação com compostos por diferentes períodos, adicionar 50 μL da solução corante por poço às placas que foram incubadas com compostos por 10 e 60 min. Incubar as placas a 37 °C durante 20 min.
      NOTA: Preparar soluções de coloração de reserva por ponto de tempo adicionando 8 μL de solução Hoechst 33342 20 mM (concentração final é de 5 μM), 32,5 μL de solução de iodeto de propídio (PI) 1 mM (concentração final é de 1 μM) e 650 μL de FBS não estéril a 5.810 μL de 1x PBS não estéril. Pré-aqueça FBS e PBS em banho-maria a 37 °C para evitar que as células sofram choque térmico.
   2. Realize imagens de fluorescência automatizadas usando uma lente objetiva de 20x.
   3. Repetir o mesmo procedimento de coloração e imagem (passos 1.4.1 -1.4.2) para as placas que foram incubadas com compostos por 24 (dia 3) e 72 (dia 5) h.
      NOTA: Mapas típicos de placas 2D são mostrados na Figura 2.
5. Experimento de cultura de células 3D - semeadura das células (dia 1)
   NOTA: As etapas para esta seção são idênticas às descritas para a preparação de experimentos 2D da cultura celular, incubação com os compostos testados e geração de imagens (etapas 1.1-1.4.) No entanto, neste caso, as células são preparadas como esferoides maduros compactos em uma placa de fundo em U de adesão ultrabaixa de 384 poços com paredes pretas e não transparentes. O uso de uma placa desse tamanho permite que dois compostos sejam comparados em um experimento.
   1. Repita as etapas 1.2.1-1.2.9 do protocolo de experimento 2D com uma cultura de células LLC.
   2. Após a contagem das células, preparar 25 mL da suspensão celular. Semeando 1.000 células por poço em todos os poços em 50 μL de DMEM em uma placa de fundo em U de baixa ligação de 384 poços.
   3. Centrifugar a 40 × g por 30 s e agitar com um agitador de placas a 250 rpm por 1 min para agitar as células das paredes dos poços até o fundo.
   4. Coloque as placas numa incubadora a 37 °C e 5% CO₂ sobre as tampas das placas de plástico extra para evitar o aquecimento irregular do fundo da placa durante 48 horas.
6. Experimento de cultura de células 3D - adição dos compostos (dia 3)
   1. Monitore as células em placas por microscopia para garantir que esferoides maduros compactos tenham se formado.
   2. Preparar uma diluição seriada dos compostos estudados em placas transparentes autoclavadas de polipropileno. Neste caso, inclua um composto adicional. Faça as seguintes soluções para medições de pontos de tempo individuais:
      1. Para obter soluções de 175 μM e 350 μM de gramicidina S, adicionar 1,8 μL de solução-estoque de 20 mM a 198,2 μL de DMEM e adicionar 3,6 μL de estoque a 196,4 μL de DMEM correspondentemente.
      2. Para obter soluções de 175 μM e 350 μM de LMB002, forma "ring-open", adicionar 1 μL de solução-mãe de 40 mM a 199 μL de DMEM e adicionar 1,8 μL de estoque a 198,2 μL de DMEM correspondentemente.
      3. Para obter soluções de 350 μΜ e 1.750 μM de LMB002, forma de "anel fechado", adicionar 1,8 μL de solução estoque de 40 mM a 198,2 μL de DMEM e adicionar 8,8 μL de estoque a 191,2 μL de DMEM correspondentemente.
   3. Execute três réplicas adicionais para obter quatro conjuntos de cada ponto de concentração. Adquira diluições seriadas retirando 20 μL de cada poço inicial, transferindo-o para o poço, com 180 μL de DMEM, e misturando completamente.
      NOTA: Trabalhar com compostos fotocomutáveis requer ajuste de iluminação para evitar a fotoisomerização traseira. Recomenda-se apagar as luzes em armários estéreis.
   4. Obter as concentrações finais dos compostos em poços transferindo 20 μL das soluções preparadas cada vez em 128 poços contendo 50 μL de DMEM. Adicionar 20 μL de DMEM cada vez em três poços para servir de controle. Cubra as placas com papel alumínio ou cobertura protetora plástica para evitar fototroca ou evaporação.
   5. Coloque as placas em uma incubadora de cultura celular sobre tampas de placas plásticas para o tempo de incubação escolhido.
7. Experimento de cultura de células 3D - coloração e imagem (dias 3-6)
   1. Preparar a solução corante por ponto de tempo adicionando 13 μL de solução de calceína AM 1 mM (concentração final é de 1 μM), 22 μL de solução Hoechst 33342 20 mM (concentração final é de 33 μM), 40 μL de solução PI 1 mM (concentração final é de 3 μM), 300 μL de FBS não estéril a 2.625 μL de 1x PBS não estéril. Pré-aqueça FBS e PBS em banho-maria a 37 °C para evitar que as células sofram choque térmico.
   2. Após incubação por diferentes períodos com os compostos, adicionar 20 μL da solução corante por poço aos poços que foram incubados com compostos por 10 min. Incubar a 37 °C durante 2 h.
   3. Realize imagens confocais de fluorescência usando uma lente objetiva de 20x.
   4. Repetir o mesmo procedimento de coloração e imagem para poços que foram incubados com compostos por 24 (dia 4) e 72 (dia 6) h.
      NOTA: Neste experimento, a calceína AM é usada como um terceiro componente da solução de coloração multicolorida. As imagens obtidas de experimentos 2D e 3D são analisadas utilizando-se o software automatizado de análise de imagens do instrumento. Células co-coradas com corantes Hoechst e iodeto de propídio são consideradas necroticamente mortas, e sua fração em função da concentração é usada para calcular o valor de IC₅₀ .

Figura 2: Exemplo de mapas típicos de placas para os experimentos de cultura 2D. Códigos de cores para os compostos e controle são indicados. As concentrações dos compostos testados (números dentro dos poços) são dadas em μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Determinação da eficiência de fotocomutação em um substituto de tecido

1. Montar o trem óptico para a irradiação da amostra, conforme mostrado na Figura 3 (consistindo em um cabo óptico da fonte de luz laser, uma lente com distância focal variável, uma seringa com uma tampa não transparente e uma extremidade de corte plana).
   1. Ao alterar a distância focal e a abertura da lente, obtenha um feixe plano de luz com um diâmetro 1-1,5 mm maior do que o diâmetro interno da seringa usada, mas que ainda esteja, tanto quanto possível, dentro da abertura.
2. Use uma seringa de 5 mL com uma extremidade cortada e um diâmetro interno de 12,4 mm e seja coberta com uma tampa plástica não transparente. Em uma potência de laser de 200 mW, defina a densidade de potência na saída do sistema óptico em ~103 mW/cm² conforme medido com um fotômetro.
   NOTA: Todas as operações subsequentes devem ser realizadas em uma sala escura com o mínimo possível de iluminação do local de trabalho.
3. Preparar 3 ml de solução-mãe LMB002 (forma "fechada em anel") em PBS com uma concentração de 1 mg/ml.
4. Prepare uma amostra de tecido modelo carregada com a fotoforma inativa de LMB002 em um recipiente plástico. Em uma corrida típica, 5 g de carne de porco picada fresca são misturados mecanicamente com 277 μL de solução estoque LMB002 e 260 μL de PBS para atingir a concentração final de 50 mg/kg na amostra, e a relação tecido/PBS de ~9/1 (v/v).
5. Encha a seringa com a amostra preparada, certificando-se de que não há bolhas de ar no interior, e forme uma superfície plana na extremidade de exposição (corte).
   NOTA: O cilindro da amostra na seringa deve ocupar ~40 mm ao longo do eixo.
6. Irradiar a amostra no trem óptico como mostrado na Figura 3 por 9 min 44 s, correspondendo a ~60 J/cm² de exposição.
7. Prepare fatias de 4 mm de espessura da amostra após a exposição, empurrando-a para fora da seringa usando o pistão e cortando-a com um bisturi. Pesar e colocar as fatias em tubos de ensaio separados e marcá-las pela distância média (mm) da superfície irradiada.
8. Preparar duas amostras de controle (quantidade ótima, 0,5-0,7 g) em tubos de ensaio: em um, carne picada misturada com 10% (volume) de PBS (54 μL), e no outro, a amostra de tecido modelo obtida na etapa 2.4 irradiada por luz laser de 500 mW por 10 min para garantir que todas as moléculas LMB002 "ring-closed" sejam convertidas para a forma "ring-open".
9. Adicionar a cada fatia e às amostras controle a mistura acetonitrila-água (70%/30% v/v, suplementada com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,01% de ácido trifluoroacético (1,4 mL/g). Misture bem o conteúdo usando uma haste de vidro.
10. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min e centrifugar as misturas a 5220 x g durante 20 min ou centrifugar a 20 x g durante 30 min duas vezes para remover o material insolúvel e recolher o sobrenadante.
11. Recolher cuidadosamente os sobrenadantes (~0,7 ml) e centrifugar-os novamente a 16.000 x g durante 30 minutos.
12. Coletar os sobrenadantes (~0,5 mL cada) e analisá-los por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (HPLC RP) com coluna analítica C18, gradiente linear A:B de 3,46% B/min, vazão de 2,0 mL/min e 100 μL de volume injetado. Registar os cromatogramas detectados por UV a 570 nm (detecção da forma "anel-fechado") e 270 nm (detecção da forma "anel-aberto"). Utilizar as amostras não irradiadas (passo 2.4) e de controlo irradiado (passo 2.8) para determinar os tempos de retenção específicos de ambas as fotoformas (eluente A: aquoso 0,1% TFA; eluente B: 90% acetonitrila-água, 0,1% TFA) e calibrar o método.
13. Determinar as quantidades reais de fotofórmios LMB002 nas amostras analisadas utilizando as curvas de calibração obtidas através da tomada e análise dos cromatogramas de soluções LMB002 de concentrações conhecidas. Para calibração, preparar soluções LMB002 "anel-fechadas" diluindo a solução-mãe (passo 2.3) com mistura acetonitrila-água (70%/30% v/v suplementada com TFA 0,01%) para obter 0,36, 0,9 e 3,6 μg por 100 μL (o volume injetado); O gradiente eluente e a taxa de fluxo são os mesmos do passo 2.12.
14. Repetir o experimento (passos 2.4-2.12) três vezes e plotar a porcentagem normalizada de cada fotoforma na parcela (porcentagem) versus a distância (da superfície do tecido irradiado). Calcule as estatísticas (ou seja, desvio padrão em cada ponto de concentração).

Figura 3: Arranjo experimental para determinação da eficiência de fotoconversão em tecido modelo. (A) esquemático e (B) fotografia; 1, cabo óptico da fonte de luz laser; 2, lente com distância focal variável; e 3, mistura salina tamponada com fosfato de carne picada LMB002 colocada em 4, uma seringa com tampa não transparente e frontend cortada (mostrada em (B) sem a tampa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Determinação da eficácia anticâncer in vivo

NOTA: O cronograma do experimento e os pontos de extremidade são mostrados na Figura 4. As normas de cuidados com os animais no período pós-tratamento devem cumprir as regras 3R – o alojamento deve incluir a densidade adequada das gaiolas e a disponibilidade de recursos. Sempre que possível, adote métodos de manejo de animais não aversivos, como túnel ou cupping.

Figura 4: Cronograma do experimento terapêutico in vivo . Designação dos grupos experimentais, detalhes da terapia, desfechos e cronogramas de análise post mortem . Abreviações: LLC = Lewis lung carcinoma; IV = intravenosa; SC = subcutâneo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação das células cancerosas para inoculação subcutânea (dia 0).
   1. Passagem das células LLC em DMEM (4,5 g/L de glicose) com SFB a 10%, penicilina a 100 U/mL e estreptomicina a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Colher as células utilizando solução de tripsina-EDTA a 0,05%, centrifugar e suspender em DMEM sem soro.
   3. Conte as células e determine sua viabilidade usando um hemocitômetro e teste de exclusão do azul de tripano.
   4. Preparar a suspensão celular final com concentração de 10 × 10⁶ células/mL em mistura de DMEM e Matrigel (1:1). Mantenha a suspensão no gelo antes da injeção.
2. Inoculação celular LLC (dia 0)
   1. Coloque o camundongo fêmea adulta C57BL/6NCrl (pesando ~20 g) na câmara de indução do aparelho de anestesia com isoflurano. Realizar sedação a 5% de isoflurano e aguardar até que o animal esteja totalmente inconsciente.
   2. Remova o pelo da área de inoculação celular por barbear.
   3. Inocular 5 × 10⁵ células LLC em ~100 μL de DMEM: mistura de Matrigel (1:1) no membro posterior direito.
      NOTA: Sempre que possível, aderir à prática de uso de agulha única.
3. Administração de compostos e fotoirradiação
   NOTA: Em 5-8 dias pós-inoculação, os animais estão prontos para o tratamento quando seus tumores são palpáveis e atingiram ~50-100 mm³ volume. Efectuar todas as operações subsequentes com LMB002 e ratinhos tratados por este composto em condições semiescuras (uma lâmpada LED de 4 W a pelo menos 5 m do local de trabalho).
   1. Dissolver LMB002 ("forma fechada em anel") em solução salina fisiológica estéril na concentração de 1 mg/mL para a dose de 5 mg/kg (IV) para obter soluções homogêneas azuis escuras.
   2. Antes da irradiação, montar aleatoriamente quatro grupos de oito animais e retirar a pelagem do tumor e áreas próximas por meio da tricotomia.
   3. Coloque um rato no suporte para injeções intravenosas e pré-aqueça a cauda do animal em banho-maria a 37 °C para tornar a veia caudal visível.
      OBS: Considerar analgesia pré-operatória.
   4. Injetar o composto a 5 mL/kg na veia da cauda. Para os dois grupos controle, injetar 100 μL de solução salina (por via intravenosa) por animal (20 g de peso corporal). Garantir que os animais dos dois grupos experimentais recebam o composto testado na fotoforma inativa (1 mg/mL em solução salina).
      NOTA: Sempre que possível, aderir à prática de uso de agulha única.
   5. Em seguida, 2 h 45 min após a injeção do composto, coloque o rato sob anestesia. Induzir sedação com isoflurano a 3%-4% em oxigênio. Manter a anestesia por 15 minutos com isoflurano a 0,5%-1% em oxigênio.
   6. Cubra o rato com uma máscara preta que possua um orifício expondo apenas a área do tumor à luz.
   7. Ligue o módulo de diodo laser com um laser de 650 nm e ajuste a potência do laser vermelho para 200 mW e o laser guia azul/UV para 2 mW.
      NOTA: Use óculos de proteção azuis quando o dispositivo a laser estiver ligado.
   8. Meça o fluxo de luz do laser vermelho (longe dos ratos) com um fotômetro e determine a distância do cabo óptico onde o fluxo de luz é de 100 mW/cm². Fixe o cabo em um suporte para garantir que a fonte de luz esteja na distância determinada do tumor e a luz cubra toda a área do tumor. Use luz laser guia azul/UV durante este procedimento.
   9. Ligue o laser vermelho para irradiar a área do tumor por 20 min.
   10. Após a irradiação, desligue o fluxo de isoflurano, devolva o animal à sua gaiola e observe cuidadosamente sua condição nos próximos 30 min.
       NOTA: Após a administração do composto, mantenha os ratos no escuro durante 2 dias. Apenas o ciclo do dia-luz deve ser alterado; todas as outras condições de habitação devem permanecer inalteradas.
4. Observações pós-tratamento
   1. Observe os animais diariamente e meça o peso e as dimensões de seus tumores. Medir o volume tumoral e observar a progressão da necrose.
      NOTA: As normas de cuidados com os animais no período pós-tratamento devem cumprir as regras 3R – o alojamento deve incluir a densidade adequada das gaiolas e a disponibilidade de recursos.
   2. Use os dados coletados na etapa anterior para avaliar a mortalidade. Determine a taxa de sobrevivência usando o procedimento padrão.
      OBS: Os animais devem ser sacrificados e contados como mortos quando apresentarem sinais clínicos graves (perda de peso corporal superior a 15%, ulceração tumoral não cicatriza em 7 dias e vocalização) ou assim que o volume tumoral atingir 2.500^mm3.

Resultados

Neste trabalho, experimentos com células 2D e 3D foram conduzidos para determinar o CI₅₀ para as formas "ring-closed" e "ring-open" de LMB002 (ver Figura 1) em diferentes tempos de incubação. Esses valores foram comparados com os obtidos para o peptídeo protótipo, a gramicidina S (utilizada como controle positivo). Um conjunto típico de imagens da incubação em cultura LLC cultivada em 2D após a coloração é mostrado na Figura 5. A cocoloração com Hoechst 33342 (azul) e iodeto de propídio (vermelho), resultando em diferentes tons de roxo em uma fração maior de células no caso de tratamento com a forma "anel-aberta" em comparação com "anel-fechado", indica uma diferença notável na citotoxicidade entre duas formas que pode ser facilmente quantificada. O exemplo demonstrado de um experimento bem-sucedido é baseado nos dados coletados usando o formato de placa de 96 poços, onde as variantes peptídicas em concentrações variáveis foram adicionadas, como mostrado na Figura 2. Dados semelhantes podem ser obtidos com placas de 384 poços e de alta densidade. No entanto, como os volumes por poço são reduzidos, os erros técnicos e sistemáticos e, como resultado, a precisão da determinação do CI₅₀ diminuirão com o aumento da densidade do poço.

Figura 5: Imagens representativas do ensaio de citotoxicidade na LLC cultivada em monocamada. As células foram coradas com Hoechst 33342 (azul) e iodeto de propídio (vermelho). Os tempos mostrados: 10 min, 60 min, 24 h e 72 h são tempos de incubação com compostos. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fotoconversão do LMB002 por irradiação com luz laser em um tecido modelo - picanha fresca de porco - foi determinada usando uma amostra composta de carne picada misturada com LMB002 forma "ring-fechada" (inativa) dissolvida em PBS e medindo a conversão desta forma inativa para a forma LMB002 "ring-open" (ativado) na direção da propagação da radiação. A amostra foi colocada em uma seringa e irradiada de um lado com um feixe plano de radiação laser pelo tempo de exposição de ~10 min (normalmente usado em experimentos in vivo ), como mostra a Figura 3. Após a exposição, o cilindro da amostra foi dividido em partes, pressionando-se o pistão da seringa e cortando-se com bisturi os cortes de mesma altura. A concentração de LMB002 "ring-open" nos extratos dos cortes foi determinada por CLAE.

A Figura 6 ilustra as curvas dose-efeito, Figura 6A-D, obtidas a partir da análise dos dados. Para identificar a porcentagem de células mortas com cocoloração nuclear dos corantes Hoechst 33342 e PI, usamos uma ferramenta classificadora integrada que define limiares numéricos em parâmetros medidos selecionados para dividir todas as contagens de células em várias categorias. Por exemplo, quando o sinal do canal vermelho (iodeto de propídio) no controle estava no limiar (aproximadamente 110-130 unidades), as células poderiam ser classificadas como PI-positivas, consideradas mortas, ou PI-negativas, consideradas não afetadas pelos compostos. Para LMB002, podem ser observadas dependências sigmoidais da porcentagem de células positivas para iodeto de propídio na concentração do composto. A partir desses dados, é possível determinar os valores de IC₅₀.

Figura 6: Análise da citotoxicidade em cultura 2D. Ajustes de sigmoide foram obtidos na cultura LLC por (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h, e (D) 72 h-times tomados para incubação com compostos. O ajuste permite a determinação precisa dos valores de IC₅₀ (não mostrados). Abreviações: LLC = Lewis lung carcinoma; IP = iodeto de propídio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Considerando os valores de CI₅₀ obtidos, podemos concluir que a toxicidade dos três compostos aumentou com o tempo de incubação. Nosso experimento revelou que a forma "anel-aberta" de LMB002 é cerca de uma etapa de diluição menos tóxica do que o peptídeo protótipo, gramicidina S. Enquanto a forma "anel-fechado" demonstra três a quatro etapas de diluição menor toxicidade, que aumenta com o tempo de incubação. A diferença entre as duas etapas de diluição não é afetada pelo aumento do tempo de incubação e pode ser usada numericamente como^{uma janela} fototerapêutica 6 determinada experimentalmente para comparação com outros compostos em uma triagem de biblioteca potencial. O valor de IC₅₀ para gramicidina S foi estabelecido como ponto de referência para corrigir erros experimentais ou saídas diferenciais em réplicas biológicas.

Os experimentos com células 3D produziram o mesmo tipo de dados brutos - as imagens esferoides resolvidas uma por poço em uma única célula. A inclusão da calceína como terceiro corante permite a quantificação da fração de células metabolicamente ativas (observada no canal verde). Usando placas de 384 poços, aumentando o número de réplicas técnicas, excluindo pontos de tempo de co-incubação redundantes e alterando a dobra de diluição, pudemos comparar diretamente vários compostos em um único ensaio (usando placa única), como ilustrado no mapa de placas na Figura 7.

Figura 7: Mapa de placas para o experimento de cultura 3D com dois compostos. Códigos de cores para os compostos e controle são indicados. Os números nos poços são concentrações em μM. 10 min, 24 h e 72 h são tempos de incubação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 8 exibe as imagens de réplicas técnicas selecionadas de esferoides LLC crescidos a uma densidade de 1 esferoide/poço na presença de compostos testados e esferoides de controle capturados após a coloração.

Figura 8: Imagens representativas do ensaio de citotoxicidade em cultura 3D. As imagens mostram esferoides LLC de 48 h de idade corados com Hoechst 33342 (azul), calceína AM (verde) e iodeto de propídio (vermelho) após 10 min, 24 h e 72 h de co-incubação com fotoformas LMB002 e barras de escala gramicidina S = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Utilizando o software do instrumento, as curvas dose-efeito, como as do experimento 2D, foram obtidas a partir das pilhas de imagens empilhadas em z (Figura 9A). Além disso, esferoides compactos e não deformados nas culturas 3D puderam ser caracterizados pelo diâmetro esferoide inteiro (Figura 9B). Observou-se também que o diâmetro total do esferoide varia com a concentração do composto.

Figura 9: Avaliação da citotoxicidade com culturas 3D. (A) Curvas de ajuste de citotoxicidade concentração-dependente e (B) parcelas de diâmetro de esferoides dependentes da concentração obtidas nas culturas 3D de LLC co-incubadas com gramicidina S por 10 min, 24 h e 72 h e capturadas antes da coloração. As barras de erro são SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O experimento para a Etapa 2 permite a determinação das concentrações de LMB002 em ambas as fotoformas usando cromatografia líquida de alta eficiência detectada por UV. A eficiência da fotoconversão nos tecidos modelo foi facilmente avaliada e quantificada por meio deste setup (Figura 3). Os dados foram obtidos a partir da análise quantitativa dos cromatogramas dos extratos das amostras. Nestes experimentos, cromatogramas LMB002 foram detectados espectroscopicamente a 270 nm e 570 nm. A 270 nm, muitos sinais adicionais foram observados e atribuídos aos compostos co-extraídos do tecido modelo (verificados a partir do extrato controle sem o composto). Ambas as fotoformas foram suficientemente diferentes em tempos de retenção e absorbância. No entanto, o sinal LMB002 "ring-open" foi separado da linha de base desses sinais de fundo (veja um cromatograma representativo na Figura 10A). Portanto, este sinal pode ser integrado sem problemas. Em 570 nm, os cromatogramas continham apenas sinal de forma "fechado em anel" LMB002 (Figura 10B). Aqui, realizamos a determinação da concentração usando HPLC RP. No entanto, uma precisão ainda maior e limites de detecção mais baixos poderiam ser obtidos usando LC/MS como método analítico.

Figura 10: Cromatogramas representativos de LMB002 extraídos de tecidos modelo. A) Amostra a 2 mm da superfície irradiada, registada a 270 nm (LMB002 forma "ring-open" é integrada); (B) amostra a 38 mm da superfície irradiada, registrada a 570 nm (o pico do LMB002 "ring-closed" está integrado). Os valores de tempo de retenção (indicados) confirmaram adicionalmente a identidade do composto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os dados obtidos após a integração dos sinais correspondentes de todas as amostras coletadas foram utilizados para a construção dos gráficos concentração-profundidade, como mostra a Figura 11. Com base nesses gráficos, a eficiência da fotoconversão em diferentes profundidades do tecido modelo foi facilmente avaliada. Isso confirma que nossa fonte de luz vermelha induz a fotoconversão LMB002 "fechada em anel" a uma profundidade de até 1 c, na carne picada (aproximadamente 103 mW/^cm2).

Figura 11: Avaliação da eficiência de fotoconversão. Concentração (A, mg/kg) das formas LMB002 "ring-closed" (non-activated, blue dots) e "ring-open" (activado, orange dots) a diferentes distâncias da superfície irradiada do tecido modelo (L, mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados do experimento in vivo - Etapa 3 de nossa metodologia realizada de acordo com o cronograma apresentado na Figura 4 - foram representados por gráficos mostrando o crescimento tumoral em função do tempo (Figura 12) e curvas de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 13).

Figura 12: Dinâmica do crescimento tumoral em animais. Animais tratados com LMB002 em comparação com os animais tratados com veículo (modelo de aloenxerto LLC subcutâneo em camundongos C57BL/6NCrl, dose composta 7 mg/kg, IV, incubação de 2 h 40 min, depois irradiação a 650 nm, 100 mW/cm², 20 min). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Curvas de mortalidade dos animais. Animais tratados com LMB002 em comparação com os animais tratados com veículo (modelo de aloenxerto LLC subcutâneo em camundongos C57BL/6NCrl, dose composta 7 mg/kg, IV, incubação de 2 h 40 min, depois irradiação a 650 nm, 100 mW/cm², 20 min). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Compostos fotocontrolados são inéditos no desenvolvimento de fármacos; entretanto, nenhum método foi estabelecido para sua avaliação pré-clínica e clínica. O análogo mais próximo da monoterapia, a terapia fotodinâmica (TFD), é a modalidade de tratamento para uso clínico adotada por muitos países contra o câncer e está em desenvolvimento para outras indicações^19,20. Assim como a fotofarmacologia, a TFD também se baseia no uso da luz para ativar a substância bioativa (oxigênio singlete). Portanto, alguns métodos experimentais utilizados para estudos pré-clínicos e clínicos na TFD podem ser adotados para a fotofarmacologia. Por exemplo, fontes de luz, abordagens de fornecimento de luz e dispositivos médicos são bem desenvolvidos e aprovados para TFD; Eles podem ser usados diretamente para a avaliação de drogas fotocontroladas. Entretanto, a TFD e a fotofarmacologia têm muitas distinções entre si⁴, o que justifica a necessidade de estabelecer métodos específicos para esta última.

Primeiro, a substância não ativada na TFD (oxigênio) está sempre presente nos tecidos vivos em concentrações não tóxicas. Por outro lado, compostos biologicamente ativos fotocontrolados não ativados podem ter atividade residual e toxicidade indesejada. Portanto, os fármacos fotofarmacológicos ideais devem ter atividade biológica minimizada em sua forma administrada e devem ser altamente ativos em sua forma gerada pela luz, a "janela fototerapêutica"²¹ deve ser a maior possível. Encontrar o acerto e realizar a otimização hit-to-lead requer a identificação de compostos adequados e a triagem de bibliotecas relativamente grandes, já em estágios iniciais de desenvolvimento de medicamentos. Aqui, nós propusemos uma microscopia fluorescente confocal automatizada de alto rendimento para identificar compostos de fotocomutação eficientes.

O método escolhido de avaliação da citotoxicidade permite fácil implementação do requisito mais crítico - manutenção do PSS ou estabilidade do fotoisômero visível-sensível à luz. Isso porque, ao ser implementada, a exposição à luz é minimizada. Assim, ao selecionar métodos alternativos, os automatizados devem ser preferidos. Essa abordagem é confiável e informativa. O uso de culturas de células 3D (esferoides) nesta fase fornece uma compreensão holística da resposta da célula ao tratamento em um microambiente tecidual mais realista. Além disso, informações valiosas sobre o mecanismo de ação dos compostos podem ser obtidas usando a microscopia como método direto. A microscopia confocal fluorescente com protocolo de coloração adequado permite a avaliação visual da morfologia das células e esferoides; Detalhes importantes sobre a morte celular e alterações no interior das células também podem ser detectados.

Em segundo lugar, a aplicação de luz requer uma escolha cuidadosa da dosagem de luz. Na TFD, a superdosagem de luz é extremamente prejudicial aos tecidos²². A terapia fotofarmacológica pode ser vantajosa sob irradiação excessiva de luz. O limite superior da substância ativada é definido pela dose administrada da substância não ativada e sua farmacocinética. No entanto, a dosagem de luz ainda é um problema na fotofarmacologia. Deve-se tomar cuidado para garantir que a densidade de potência irradiante e o tempo de exposição não sejam inferiores ao necessário para a terapia. Em princípio, a geração da substância ativada pode ser monitorada in vivo. No entanto, por razões bioéticas, propusemos um experimento com um tecido modelo (carne picada fresca) misturado com o composto não ativado¹⁵. Este experimento é simples e pode ser modificado para usar diferentes fontes de luz. Também pode ser adaptado para a estimativa fotofísica da dosagem de luz e a medição de influências térmicas. Aqui, novamente, usando tecidos modelo, a exposição à luz é possível minimizar, comparada, por exemplo, com a determinação mais precisa da eficiência de fotocomutação nas condições in vivo , uma alternativa que pode sempre ser interessante de considerar.

Finalmente, os compostos que demonstram características superiores nas telas de toxicidade in vitro e são eficientemente fototrocados a pelo menos 1-1,5 cm de profundidade no tecido modelo podem ser selecionados para estudos in vivo caros, trabalhosos e demorados. Neste protocolo, utilizamos a mesma linhagem celular (LLC) da avaliação in vitro para gerar o modelo de câncer aloenxerto. A dinâmica de crescimento tumoral, a mortalidade e a contagem de metástases são os parâmetros mais adequados para avaliar a eficácia antineoplásica. Em comparação com a quimioterapia convencional, um fator adicional é aplicado no tratamento fotofarmacológico - a luz. Para tanto, são necessários dois grupos de animais controle: um que recebe apenas o veículo e outro que recebe o veículo e a irradiação. Esta configuração permite a avaliação do impacto da luz sobre os parâmetros medidos. Em nosso experimento, os animais dos dois grupos experimentais receberam o composto não ativado, e os tumores dos camundongos de um grupo foram irradiados. O regime de irradiação foi idêntico para os grupos controle e tratamento. A comparação com a quimioterapia de referência não é necessária nesta fase, pois o principal objetivo do experimento é demonstrar o efeito combinado da aplicação de luz e composto. Os compostos de melhor desempenho que exibem esse efeito podem então ser selecionados para um estudo mais aprofundado sobre sua toxicidade in vivo e comparação com benchmarks para a tomada de decisões importantes sobre seu desenvolvimento. Tecnicamente, o experimento in vivo que descrevemos pode ser facilmente adaptado a estudos farmacocinéticos ou farmacodinâmicos, por exemplo, de um composto que já está selecionado como líder do medicamento.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 1100 Series capillary LC system	ALSI-Chrom (Agilent distributor)	-
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line	ECACC	90020104
C57BL/6NCrl mice, female, inbred	Charles River	Strain code: 027
CelCulture, CO2 incubator	Esco Micro	CCL-170B
Corning Matrigel Basement membrane matrix	Merck	CLS354234
Corning, 384- well spheroid microplates	Merck	CLS3830
Fetal bovine serum	Merck	F7524
Gibco, DPBS	Thermo Fisher Scientific	21600044
Gramicidin S	Lumobiotics		Custom synthesis
HyClone, DMEM/high glucose	Cytiva	SH30003.04
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system	Cytiva	29240358
Invitrogen, Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430
Isoflurane anesthesia machine	ASA	S/N ASA 1305
L-glutamine, 200 mM solution	Merck	G7513
LIKA-surgeon, diode surgery laser	Fotonika plus	-
LMB002	Lumobiotics		Custom synthesis
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized	Merck	P4333
PhenoPlate, 96-well plates	PerkinElmer	6055302
Photometer PCE-LED 20	PCE Instruments	PCE-LED 20
Thermo Scientific, Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249
Thermo Scientific, Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	J66764-MC
Trypan blue, 0.4% solution	Merck	T8154
Trypsin–EDTA, 10 x solution	Merck	T4174
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2	Santa Cruz Biotechnology	sc-200263
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm	Santa Cruz Biotechnology	sc-360882
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm)	Altmann Analytik (Avantor distributor)	GR5103827