Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana

Resumo

Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.

Resumo

Considerando o crescente impacto da terapia com células-tronco, preocupações de biossegurança têm sido levantadas em relação à potencial contaminação ou transmissão de infecção devido à introdução de produtos derivados de animais durante a manipulação in vitro . Os componentes xenogênicos, como colagenase ou soro fetal bovino, comumente usados durante as etapas de isolamento e expansão celular podem estar associados aos riscos potenciais de reatividade imunológica ou infecção viral, bacteriana e príon nos pacientes receptores. Seguindo as diretrizes de boas práticas de fabricação, a dissociação química do tecido deve ser evitada, enquanto o soro fetal bovino (FBS) pode ser substituído por suplementos livres de xenogenes. Além disso, para garantir a segurança dos produtos celulares, é importante a definição de métodos mais fiáveis e reprodutíveis. Desenvolvemos um método inovador, completamente livre de xenogenes, para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sem alterar suas propriedades em comparação com os protocolos padrão cultivados com colagenase FBS. Aqui, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram isoladas do tecido adiposo abdominal. A amostra foi picada mecanicamente com tesoura/bisturi, microdissecada e dispersa mecanicamente em placa de Petri de 10 cm e preparada com incisões de bisturi para facilitar a fixação dos fragmentos de tecido e a migração de hASCs. Seguindo as etapas de lavagem, os hASCs foram selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática. Os hASCs isolados foram cultivados com meio suplementado com lisado plaquetário humano livre de heparina a 5% e destacados com um substituto de tripsina livre de animais. Seguindo as instruções das boas práticas de fabrico (BPF) sobre a produção de produtos celulares destinados à terapia humana, não foram utilizados antibióticos em nenhum meio de cultura.

Introdução

Nas últimas décadas, a crescente demanda por tratamentos terapêuticos inovadores deu origem a esforços significativos e investimentos em recursos no campo da medicina translacional¹. Os produtos à base de células estão associados a riscos determinados pela fonte celular, pelo processo de fabricação (isolamento, expansão ou modificação genética) e pelos suplementos não celulares (enzimas, fatores de crescimento, suplementos de cultura e antibióticos), e esses fatores de risco dependem da indicação terapêutica específica. A qualidade, a segurança e a eficácia do produto final podem ser profundamente influenciadas pelos elementos acima indicados

Protocolo

Os hASCs foram isolados do tecido adiposo abdominal de uma mulher saudável que foi submetida à reconstrução mamária usando retalhos autólogos abdominais (retalhos perfuradores epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) no Hospital Universitário de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suíça. A parte descartada do retalho e do tecido adiposo foi obtida após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Departamento de Biobanco DAL do hospital (número 314 GGC) e comitês de ética de acordo com a Declaração de Helsinque.

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um exaustor de fluxo la....

Resultados

Aplicando o método de isolamento detalhado acima, os hASCs foram obtidos com sucesso a partir de amostras de tecido adiposo abdominal sem o uso de colagenase. Além disso, os hASCs foram expandidos em condições livres de xenogenea, na presença de hPL e sem quaisquer outros componentes de origem animal. Os resultados a seguir corroboram o protocolo e são obtidos a partir de hASCs cultivadas em paralelo com hPL e com FBS como condição controle.

Após o aparecimento inicial do cluster, os .......

Discussão

As células-tronco derivadas de tecido adiposo têm atraído o interesse da pesquisa translacional na última década devido à sua abundância, métodos de isolamento rápidos e acessíveis, alta taxa de proliferação in vitro/in vivo e propriedades de caule/diferenciação^18,19,20. Como resultado, as hASCs são consideradas um excelente candidato para estratégias baseadas em células em medicina regenerativ.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013