Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Resumo

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Resumo

O córtex cerebral é a estrutura cerebral mais externa e é responsável pelo processamento da entrada sensorial e da saída motora; É visto como a sede de habilidades cognitivas de ordem superior em mamíferos, em particular, primatas. Estudar as funções gênicas em cérebros de primatas é um desafio devido a razões técnicas e éticas, mas o estabelecimento da tecnologia organoide cerebral permitiu o estudo do desenvolvimento cerebral em modelos tradicionais de primatas (por exemplo, macaco rhesus e sagui-comum), bem como em espécies de primatas anteriormente inacessíveis experimentalmente (por exemplo, grandes macacos), em um sistema eticamente justificável e menos exigente tecnicamente. Além disso, organoides cerebrais humanos permitem a investigação avançada de distúrbios neurológicos e do neurodesenvolvimento.

Como os organoides cerebrais recapitulam muitos processos de desenvolvimento cerebral, eles também representam uma ferramenta poderosa para identificar diferenças e comparar funcionalmente os determinantes genéticos subjacentes ao desenvolvimento cerebral de várias espécies em um contexto evolutivo. Uma grande vantagem do uso de organoides é a possibilidade de introduzir modificações genéticas, o que permite testar as funções dos genes. No entanto, a introdução de tais modificações é trabalhosa e cara. Este artigo descreve uma abordagem rápida e econômica para modificar geneticamente populações celulares dentro das estruturas semelhantes a ventrículos de organoides cerebrais de primatas, um subtipo de organoides cerebrais. Este método combina um protocolo modificado para a geração confiável de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de saguis humanos, chimpanzés, macacos rhesus e saguis comuns com uma abordagem de microinjeção e eletroporação. Isso fornece uma ferramenta eficaz para o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos que também pode ser aplicada para modelagem de doenças.

Introdução

Investigar o desenvolvimento (pato)fisiológico e a evolução do córtex cerebral é uma tarefa formidável que é dificultada pela falta de sistemas modelo adequados. Anteriormente, tais estudos estavam confinados a modelos bidimensionais de cultura celular (como progenitor neural primário ou culturas de células neuronais) e modelos animais evolutivamente distantes (como roedores)^1,2. Embora esses modelos sejam úteis para abordar certas questões, eles são limitados na modelagem da complexidade, composição do tipo celular, arquitetura celular e padrões de expressão gênica do neocórtex humano em desenvolvimento em es....

Protocolo

1. Cultura de iPSCs de primatas

NOTA: Devido à sua robustez, o método aqui apresentado pode ser aplicado a qualquer linhagem iPSC de primatas. Neste artigo, descrevemos a produção de organoides cerebrais a partir de linhagens iPSC humana (iLonza2.2)29, chimpanzé (Sandra A)³⁰, macaco rhesus (iRh33.1)²⁹ e sagui-comum (cj_160419_5)³¹. As condições de cultivo estão resumidas na Tabela 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos utili....

Discussão

Os procedimentos aqui descritos representam um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de diferentes espécies de primatas com uma abordagem de eletroporação direcionada. Isso permite a expressão ectópica de um GOI em um sistema modelo que emula o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex de primatas (incluindo humanos). Este protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas usa os mesmos materiais (por exemplo, mídia) e etapas de protocolo para todas as quatro esp?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 µL Microloader	Eppendorf	5242956003
2-Mercaptoethanol	Merck	8.05740.0005
35 mm cell culture dishes	Sarstedt	83.3900
60 mm cell culture dishes	CytoOne	CC7682-3359
Activin A	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope	Zeiss		replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)	Gibco	17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Gibco	11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Forskolin	Selleckchem	2449
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050-061	glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)	Sigma-Aldrich	H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)	PeproTech	450-03
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)	Leica	10473849	replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel	Corning	354277/354234	basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Paraformaldehyde	Merck	818715	handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	PanBiotech	P06-07100
Petri dish electrode chamber	self-produced (see Supplemental File 1)		also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT	borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound	MerckMillipore	529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	PeproTech	AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE	Gibco	12604-013	recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305