Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

Resumo

Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.

Resumo

As ilhotas pancreáticas de Langerhans, que são pequenas coleções 3D de células endócrinas e de suporte especializadas intercaladas por todo o pâncreas, têm um papel central no controle da homeostase da glicose através da secreção de insulina pelas células beta, que reduz a glicemia, e glucagon pelas células alfa, que eleva a glicemia. As vias de sinalização intracelular, incluindo aquelas mediadas pelo AMPc, são fundamentais para a secreção regulada dos hormônios alfa e beta. A estrutura 3D das ilhotas, embora essencial para a função coordenada das ilhotas, apresenta desafios experimentais para estudos mecanísticos das vias de sinalização intracelular em células primárias das ilhotas humanas. Para superar esses desafios e limitações, este protocolo descreve uma plataforma microfluídica e de imagem integrada de células vivas usando pseudoilhotas humanas primárias geradas a partir de doadores sem diabetes que se assemelham a ilhotas nativas em sua morfologia, composição e função. Estas pseudoilhotas são controladas pelo tamanho através do processo de dispersão e reagregação das células primárias das ilhotas humanas. No estado disperso, a expressão gênica das ilhotas celulares pode ser manipulada; por exemplo, biossensores como o biossensor cAMP codificado geneticamente, cADDis, podem ser introduzidos. Uma vez formadas, as pseudoilhotas que expressam um biossensor codificado geneticamente, em combinação com microscopia confocal e uma plataforma de microperifusão, permitem a avaliação sincrônica da dinâmica do biossensor fluorescente e dos perfis secretores de hormônios alfa e beta para fornecer mais informações sobre os processos e a função celular.

Introdução

As ilhotas de Langerhans são miniórgãos espalhados pelo pâncreas cuja função é crucial para a manutenção da homeostase da glicose. A insulina é secretada pelas células beta após o metabolismo da glicose, o aumento da relação ATP/ADP, o fechamento dos canais de potássio sensíveis ao ATP, a despolarização da membrana plasmática e o influxo de cálcio extracelular¹. A secreção de glucagon pelas células alfa é menos compreendida, mas tem sido postulado que as vias intracelular e parácrina contribuem para a exocitose dos grânulos de glucagon ^2,3,4. Tanto o d....

Protocolo

As ilhotas humanas (N = 4 preparações) foram obtidas através de parcerias com o Programa Integrado de Distribuição de Ilhotas, Programa de Análise do Pâncreas Humano, Prodo Laboratories, Inc., e Imagine Pharma. O Comitê de Revisão Institucional da Universidade Vanderbilt não considera espécimes pancreáticos humanos desidentificados como pesquisa em seres humanos. Esse trabalho não seria possível sem doadores de órgãos, suas famílias e organizações de captação de órgãos. Consulte a Tabela 1 para obter informações demográficas dos doadores. Ilhotas humanas de doadores de pâncreas sem diabetes foram isoladas com menos de 15 h de tempo de isquemia fria.

Discussão

A integração de um sistema de microperifusão, pseudoilhotas que expressam biossensores e microscopia confocal de varredura a laser permite a avaliação sincrônica de eventos de sinalização intracelular e perfis secretores hormonais dinâmicos. O sistema dinâmico de microperifusão pode fornecer uma série de estímulos bem definidos às pseudoilhotas e permite a coleta do efluente, no qual as concentrações de insulina e glucagon podem ser medidas por ELISA comercialmente disponível. Ao mesmo tempo, imagens de .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component