Uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerosas pancreáticas

Resumo

Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.

Resumo

A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.

Introdução

As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular ^1,2 e desempenham um papel crítico no câncer³. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar⁴ devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações na^morfologia mitocondrial3,5,6,7^, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos....

Protocolo

1. Preparação do material

1. Cultivar 2 x 10⁶ células Panc02 em 12 mL de meio DMEM (10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), e manter a 37 °C e 95% de umidade em atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 48 h.
2. Recolher células de Panc02, centrifugar a 28 x g durante 2 minutos e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Certifique-se de que a amostra tem um tamanho adequado (1 x 10⁷ células), caso contrário, as seguintes etapas de fixação e desidratação não funcionarão bem.
3. Adicionar 1 mL de glutaraldeído a 2,5% como fixador para fixar as células frescas de Panc....

Discussão

O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de al.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2