Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Resumo

A contratilidade da actomiosina desempenha um papel importante na morfogênese celular e tecidual. No entanto, é um desafio manipular agudamente a contratilidade da actomiosina in vivo . Este protocolo descreve um sistema optogenético que inibe rapidamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em embriões de Drosophila , revelando a perda imediata da tensão epitelial após a inativação da actomiosina in vivo.

Resumo

As forças contráteis geradas pela actina e pela miosina não muscular II ("contratilidade da actomiosina") são críticas para alterações morfológicas de células e tecidos em múltiplas escalas de comprimento, tais como divisão celular, migração celular, dobramento epitelial e morfogênese ramificada. Uma compreensão profunda do papel da contratilidade da actomiosina na morfogênese requer abordagens que permitam a rápida inativação da actomiosina, o que é difícil de ser alcançado usando abordagens genéticas ou farmacológicas convencionais. O protocolo apresentado demonstra o uso de um sistema de dimerização optogenética baseado em CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inibir a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com controles temporais e espaciais precisos. Neste sistema, CRY2 é fundido à forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), enquanto CIBN é ancorado à membrana plasmática. A dimerização mediada pela luz azul de CRY2 e CIBN resulta em rápida translocação de Rho1DN do citoplasma para a membrana plasmática, onde inativa a actomiosina inibindo Rho1 endógeno. Além disso, este artigo apresenta um protocolo detalhado para acoplamento da inativação da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN com ablação a laser para investigar o papel da actomiosina na geração de tensão epitelial durante a formação do sulco ventral de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado a muitos outros processos morfológicos que envolvem a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com modificações mínimas. Em geral, esta ferramenta optogenética é uma abordagem poderosa para dissecar a função da contratilidade da actomiosina no controle da mecânica tecidual durante o remodelamento dinâmico tecidual.

Introdução

A contratilidade da actomiosina, força contrátil exercida pela miosina II não muscular (doravante denominada "miosina") sobre a rede de actina-F, é uma das forças mais importantes na mudança da forma celular e na condução da morfogênese tecidual ^1,2. Por exemplo, a ativação da contratilidade da actomiosina no domínio apical das células epiteliais resulta em constrição apical, o que facilita uma variedade de processos morfogenéticos, incluindo dobramento epitelial, extrusão celular, delaminação e cicatrização de feridas 3,4,5,6,7

Protocolo

1. Montagem do cruzamento genético e preparo do copo de coleta de óvulos

1. Selecionar moscas fêmeas (virgens) da linhagem optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) em uma almofada de CO₂ sob um estereomicroscópio e montou um cruzamento com moscas machos da linha de driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.
   NOTA: O 67 e o 15 significam GAL4 maternal-tubulina inserida no segundo (II) e terceiro (III) cromossomos, respectivamente⁵². A linha GAL4 utilizada neste protocolo também expressa a cadeia leve reguladora de miosina marcada com mCherry Sqh (Spaghetti squash)

Discussão

Este protocolo descreveu o uso combinado de optogenética e ablação a laser para sondar mudanças na tensão tecidual imediatamente após a inativação da contratilidade da actomiosina. A ferramenta optogenética aqui descrita aproveita a forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inibir agudamente a contratilidade endógena de Rho1 e actomiosina dependente de Rho1. A caracterização prévia do Opto-Rho1DN no contexto da formação do sulco ventral de Drosophila demonstrou que a ferramenta é altamente e.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation