Ligadura do átrio esquerdo no embrião aviário como modelo de carga hemodinâmica alterada durante o desenvolvimento vascular inicial

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo visual detalhado para a execução do modelo de ligadura atrial esquerda (LAL) no embrião aviário. O modelo LAL altera o fluxo intracardíaco, o que altera a carga de tensão de cisalhamento da parede, mimetizando a síndrome da hipoplasia do coração esquerdo. Uma abordagem para superar os desafios deste difícil modelo de microcirurgia é apresentada.

Resumo

Devido à sua configuração ventricular madura de quatro câmaras, facilidade de cultivo, acesso à imagem e eficiência, o embrião aviário é um modelo animal vertebrado preferido para estudar o desenvolvimento cardiovascular. Estudos com o objetivo de compreender o desenvolvimento normal e o prognóstico das cardiopatias congênitas adotam amplamente esse modelo. Técnicas cirúrgicas microscópicas são introduzidas para alterar os padrões normais de carregamento mecânico em um ponto de tempo embrionário específico e rastrear a cascata molecular e genética a jusante. As intervenções mecânicas mais comuns são ligadura da veia vitelínea esquerda, bandagem conotruncal e ligadura atrial esquerda (LAE), modulando a pressão vascular intramural e o estresse de cisalhamento da parede devido ao fluxo sanguíneo. O LAL, particularmente se realizado em ovo, é a intervenção mais desafiadora, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas sequenciais extremamente finas. Apesar de seu alto risco, in ovoLAL é muito valioso cientificamente, pois mimetiza a patogênese da síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE). A SHCE é uma cardiopatia congênita complexa e clinicamente relevante observada em recém-nascidos humanos. Um protocolo detalhado para in ovo LAL está documentado neste artigo. Resumidamente, embriões de aves fertilizados foram incubados a 37,5 °C e 60% de umidade constante tipicamente até atingirem os estágios 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). As cascas dos ovos foram abertas e as membranas externa e interna foram removidas. O embrião foi rodado suavemente para expor o bulbo atrial esquerdo do átrio comum. Micronós pré-montados a partir de pontos de náilon 10-0 foram suavemente posicionados e amarrados ao redor do broto atrial esquerdo. Finalmente, o embrião foi devolvido à sua posição original, e LAL foi completado. Ventrículos normais e instrumentados em LAL demonstraram diferenças estatisticamente significativas na compactação tecidual. Um pipeline eficiente de geração de modelos LAL contribuiria para estudos com foco na manipulação mecânica e genética sincronizada durante o desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Da mesma forma, este modelo fornecerá uma fonte de células perturbadas para pesquisa em cultura de tecidos e biologia vascular.

Introdução

As cardiopatias congênitas (DCC) são distúrbios estruturais decorrentes do desenvolvimento embrionário anormal¹. Além das condições genéticas, a patogênese é influenciada pela carga mecânica alterada ^2,3. A síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE), uma cardiopatia congênita, resulta em ventrículo/aorta subdesenvolvidos ao nascimento⁴ com alta taxa de mortalidade ^5,6. Apesar dos recentes avanços em seu manejo clínico, a dinâmica de crescimento e desenvolvimento vascular da SHCE ainda não

Protocolo

Os ovos brancos férteis de Leghorn são obtidos de fornecedores confiáveis e incubados de acordo com as diretrizes aprovadas pela universidade. Embriões de pintinhos, estágios 18 (dia 3) a 24 (dia 4) (os estágios apresentados neste artigo) não são considerados animais vertebrados vivos pela diretiva 2010/63/EU da União Europeia (UE) e pelas diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) nos EUA. Os embriões de pintinhos são considerados "animais vivos" após o 19º dia de incubação de acordo com as leis dos EUA, mas não para a UE. Cada ovo é rotulado com a data de início da eclosão e está programado para eclodir o mais tardar no^10º dia....

Discussão

Na SHCE, o fluxo sanguíneo é alterado devido a defeitos estruturais, levando a morfologia anormal no lado esquerdo ^4,6. O presente modelo fornece um sistema experimental prático para melhor compreender a progressão da SHCE e pode até mimetizar sua patogênese8. No entanto, estabelecer um modelo animal de SHCE clinicamente equivalente é uma tarefa desafiadora. Além do modelo LAL aviário aqui apresentado, estudos recentes em camundon.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo