Perfil Fenotípico de Neurônios Dopaminérgicos do Mesencéfalo Derivados de Células-Tronco Humanas

Resumo

Este protocolo descreve a cultura celular de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo humano, seguida de coloração imunológica e geração de perfis fenotípicos neuronais a partir de imagens microscópicas adquiridas de alto conteúdo, permitindo a identificação de variações fenotípicas devido a modulações genéticas ou químicas.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) está ligada a uma série de processos biológicos celulares que causam perda de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo (mDA). Muitos modelos celulares atuais de DP in vitro carecem de complexidade e não levam em conta múltiplos fenótipos. O perfil fenotípico em neurônios mDA derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC) pode abordar essas deficiências medindo simultaneamente uma variedade de fenótipos neuronais em um tipo de célula relevante para DP em paralelo. Aqui, descrevemos um protocolo para obter e analisar perfis fenotípicos de neurônios mDA humanos comercialmente disponíveis. Um painel de coloração fluorescente neuron-específico é usado para visualizar os fenótipos nucleares, α-sinucleína, tirosina hidroxilase (TH) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2) relacionados. O protocolo de perfil fenotípico descrito é escalável, pois utiliza placas de 384 poços, manuseio automático de líquidos e microscopia de alto rendimento. A utilidade do protocolo é exemplificada usando neurônios mDA de doadores saudáveis e neurônios mDA portadores da mutação G2019S ligada a PD no gene Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2). Ambas as linhagens celulares foram tratadas com o inibidor de quinase LRRK2 PFE-360 e as alterações fenotípicas foram medidas. Além disso, demonstramos como perfis fenotípicos multidimensionais podem ser analisados usando métodos de classificação supervisionada orientados por clustering ou aprendizado de máquina. O protocolo descrito interessará particularmente aos pesquisadores que trabalham na modelagem de doenças neuronais ou no estudo dos efeitos de compostos químicos em neurônios humanos.

Introdução

Uma variedade de processos biológicos celulares são perturbados na doença de Parkinson (DP). Por exemplo, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, defeitos de degradação proteica, interrupção do tráfego vesicular e função endolisossômica têm sido associados à perda de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos (mDA), são comumente observados na DP¹. Portanto, a DP parece envolver múltiplos mecanismos patológicos que podem interagir e piorar uns com os outros. Uma maneira útil de investigar essa interação mecanicista é a criação de uma impressão digital fenotípica abrangente ou perfil de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos (mDA).

Protocolo

1. Preparação do meio e placas para semeadura de neurônios (Dia 1)

1. Para preparar as placas para semeadura de neurônios no Dia-1, aqueça a Laminina à temperatura ambiente (TR) imediatamente antes do uso. Preparar a solução de laminina diluindo a solução-mãe de laminina (0,1 mg/ml) 1/10 em PBS+/+ frio (com Ca 2+ e Mg²⁺).
   NOTA: Todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais. As composições das soluções e dos tampões estão descritas nas Tabelas 1 a 4.
2. Em seguida, adicionar 25 μL da solução de laminina a cada poço de uma placa de 384 poços pré-revestida com poli-D-lisi....

Discussão

O perfil fenotípico é uma técnica para medir um grande número de fenótipos em células por meio da aplicação de colorações fluorescentes, microscopia e análise de imagens³. Perfis fenotípicos podem ser obtidos e comparados entre linhagens celulares ou outras condições experimentais para entender mudanças complexas na biologia celular que podem passar despercebidas ao usar uma única leitura. Descrevemos aqui a aplicação do perfil fenotípico em neurônios mDA humanos derivados de i.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.