Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

Resumo

Este protocolo descreve métodos para preparar células de fibras periféricas, maduras e nucleares do cristalino ocular para coloração por imunofluorescência para estudar interdigitações complexas célula-célula e a arquitetura da membrana.

Resumo

O cristalino é um órgão transparente e elipsoide na câmara anterior do olho que muda de forma para focalizar finamente a luz na retina para formar uma imagem clara. A maior parte desse tecido é composta por células fibrosas especializadas e diferenciadas que possuem secção transversal hexagonal e se estendem dos polos anterior para posterior do cristalino. Essas células longas e magras são fortemente opostas às células vizinhas e têm interdigitações complexas ao longo do comprimento da célula. As estruturas intertravadas especializadas são necessárias para as propriedades biomecânicas normais do cristalino e têm sido extensivamente descritas usando técnicas de microscopia eletrônica. Este protocolo demonstra o primeiro método para preservar e imunomanchar singular, bem como feixes de células de fibra de lente de camundongo para permitir a localização detalhada de proteínas dentro dessas células de forma complexa. Os dados representativos mostram a coloração das células periféricas, diferenciadoras, maduras e de fibras nucleares em todas as regiões do cristalino. Este método pode ser potencialmente utilizado em células de fibras isoladas de lentes de outras espécies.

Introdução

O cristalino é um tecido límpido e ovoide, na câmara anterior do olho, composto por dois tipos celulares, células epiteliais e^fibras1 (Figura 1). Existe uma monocamada de células epiteliais que recobre o hemisfério anterior do cristalino. As células fibrosas são diferenciadas das células epiteliais e compõem a maior parte do cristalino. As células fibrosas altamente especializadas sofrem uma programação de alongamento, diferenciação e maturação, marcada por distintas mudanças na morfologia da membrana celular da periferia do cristalino para o centro do cristalino2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

Protocolo

Os camundongos foram cuidados com base em um protocolo animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Indiana University Bloomington. Os camundongos utilizados para gerar dados representativos foram animais controle (selvagem) no fundo C57BL6/J, fêmeas e com 8-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas podem ser usados para este experimento, já que é muito improvável que o sexo dos camundongos afete o resultado do experimento.

1. Dissecção e descapsulação do cristalino

1. Eutanasiar camundongos seguindo o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" do National Institutes of ....

Discussão

Este protocolo demonstrou os métodos de fixação, preservação e imunomarcação que preservam fielmente a morfologia da membrana 3D de feixes ou células de fibras do cristalino singular de várias profundidades no cristalino. As fibras coradas do cristalino são comparadas com preparações de MEV que têm sido usadas há muito tempo para estudar a morfologia das células das fibras do cristalino. Os resultados mostram estruturas de membrana comparáveis entre as duas preparações. A ME continua sendo o padrão-our.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm plate	FisherScientific	FB0875713A
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
10X phosphate buffered saline	ThermoFisher	70011-044
1X phosphate buffered saline	ThermoFisher	14190136
48-well plate	CytoOne	CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
Curved tweezers	World Precision Instruments	501981
Dissection microscope	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software	Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (rhodamine)	ThermoFisher	R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11	VWR	76241-186
Secondary antibody
Straight forceps	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)	FisherScientific	12-565-154
Ultra-fine scissors	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)	Vector Laboratories	FL-1021-5