Metabolômica direcionada em células primárias raras

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para medir metabólitos de forma precisa e confiável em tipos celulares raros. Melhorias técnicas, incluindo um fluido de bainha modificado para a triagem celular e a geração de amostras em branco relevantes, permitem uma quantificação abrangente de metabolitos com uma entrada de apenas 5000 células por amostra.

Resumo

A função celular depende criticamente do metabolismo, e a função das redes metabólicas subjacentes pode ser estudada medindo pequenos intermediários de moléculas. No entanto, a obtenção de medidas precisas e confiáveis do metabolismo celular, particularmente em tipos raros de células, como células-tronco hematopoéticas, tradicionalmente requer o agrupamento de células de vários animais. Um protocolo agora permite que os pesquisadores meçam metabólitos em tipos raros de células usando apenas um camundongo por amostra, enquanto geram várias réplicas para tipos de células mais abundantes. Isso reduz o número de animais necessários para um determinado projeto. O protocolo aqui apresentado envolve várias diferenças importantes em relação aos protocolos metabolômicos tradicionais, tais como o uso de NaCl 5 g/L como fluido de bainha, a classificação direta em acetonitrila e a utilização de quantificação direcionada com uso rigoroso de padrões internos, permitindo medidas mais precisas e abrangentes do metabolismo celular. Apesar do tempo necessário para o isolamento de células únicas, coloração fluorescente e classificação, o protocolo pode preservar as diferenças entre os tipos celulares e tratamentos medicamentosos em grande medida.

Introdução

O metabolismo é um processo biológico essencial que ocorre em todas as células vivas. Os processos metabólicos envolvem uma vasta rede de reações bioquímicas que são fortemente reguladas e interligadas, permitindo que as células produzam energia e sintetizem biomoléculas essenciais¹. Para entender a função das redes metabólicas, os pesquisadores medem os níveis de pequenas moléculas intermediárias dentro das células. Esses intermediários servem como importantes indicadores da atividade metabólica e podem revelar insights críticos sobre a função celular.

A espectrometria de massas (EM) é a escolha mais popular para a ....

Protocolo

A criação e criação de todos os camundongos utilizados para este protocolo foram conduzidos em um biotério convencional no Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética (MPI-IE) de acordo com as regulamentações das autoridades locais (Regierungspräsidium Freiburg). Os camundongos foram eutanasiados com CO₂ e deslocamento cervical por pessoal treinado em FELASA B, seguindo diretrizes e regulamentos aprovados pelo comitê de bem-estar animal do IPM-IE e pelas autoridades locais. Nenhuma experimentação animal foi realizada, e os camundongos estavam sem encargos de saúde.

NOTA: Métodos analíticos altamente sensíveis, como o méto....

Discussão

As etapas mais críticas para a implementação bem-sucedida de metabolômica direcionada usando este protocolo são 1) uma estratégia robusta de coloração e fechamento que produzirá populações de células limpas 2) manuseio preciso de volumes de líquidos, 3) tempo reprodutível de todas as etapas experimentais, em particular todas as etapas anteriores à extração do metabólito. Idealmente, todas as amostras pertencentes a um experimento devem ser processadas e medidas em um lote para minimizar os efeitos do lo.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C yeast extract	Isotopic Solutions	ISO-1
40 µm cell strainer	Corning	352340
Acetonitrile, LC-MS grade	VWR	83640.32
ACK lysis buffer	Gibco	104921	Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP)	Sigma Aldrich	A2754
Adenosine monophosphate (AMP)	Sigma Aldrich	A1752
Adenosine triphosphate (ATP)	Sigma Aldrich	A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade	Fisher Scientific	A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm)	Waters	186009982
B220-A647	Invitrogen	103226
B220-PE/Cy7	BioLegend	103222	RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7	BioLegend	101216	RRID:AB_312799
CD150-BV605	BioLegend	115927	RRID:AB_11204248
CD3-PE	Invitrogen	12-0031-83
CD48-BV421	BioLegend	103428	RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7	BioLegend	100422	RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7	BioLegend	100722	RRID:AB_312761
cKit-PE	BioLegend	105808	RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit	Invitrogen	11415D
FACSAria III	BD
Gr1-PE/Cy7	BioLegend	108416	RRID:AB_313381
Heat sealing foil	Neolab	Jul-18
Isoleucine	Sigma Aldrich	58880
JetStream ESI Source	Agilent	G1958B
Leucine	Sigma Aldrich	L8000
Medronic acid	Sigma Aldrich	M9508-1G
Methanol, LC-MS grade	Carl Roth	HN41.2
NaCl	Fluka	31434-1KG
PBS	Sigma Aldrich	D8537
Sca1-APC/Cy7	BioLegend	108126	RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7	BioLegend	116221	RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer	Agilent	6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted	Eppendorf	30129512
UHPLC Autosampler	Agilent	G7157B
UHPLC Column Thermostat	Agilent	G7116B
UHPLC Pump	Agilent	G7120A
UHPLC Sample Thermostat	Agilent	G4761A