Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

Resumo

Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.

Resumo

As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas que têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa. Como as CTMs derivadas de tecidos somáticos são restritas por doação limitada, variações de qualidade e biossegurança, nos últimos 10 anos houve um grande aumento nos esforços para gerar CTMs a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Esforços passados e recentes na diferenciação de hiPSCs em CTMs têm se centrado em torno de duas metodologias de cultura: (1) a formação de corpos embrionários (BEs) e (2) o uso de cultura de monocamadas. Este protocolo descreve esses dois métodos representativos na derivação de CTM de hiPSCs. Cada método apresenta suas vantagens e desvantagens, incluindo tempo, custo, capacidade de proliferação celular, expressão de marcadores de CTM e sua capacidade de diferenciação in vitro. Esse protocolo demonstra que ambos os métodos podem derivar CTMs maduras e funcionais de hiPSCs. O método monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil, enquanto o método EB é caracterizado por menor consumo de tempo.

Introdução

As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas derivadas do mesoderma¹. As CTMs estão presentes em quase todos os tecidos conjuntivos². Desde que as CTMs foram descobertas na década de 1970 e isoladas com sucesso da medula óssea em 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, uma variedade de tecidos somáticos humanos (incluindo fetais e adultos) tem sido usada para isolar CTMs, como osso, cartilagem, tendão, músculo, tecido adiposo e estroma de suporte hematopoético 1,....

Protocolo

1. Manutenção de hiPSCs

1. Descongelamento do hiPSC
   1. Retire as células do nitrogênio líquido e descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C. Transferir as células de descongelamento para um tubo de 15 mL preparado com 3 mL de meio de manutenção iPSC (Tabela de Materiais). Misture suavemente o meio.
   2. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em 1 mL de meio de manutenção iPSC com 10 μM Y-27632 (pipetar as células para cima e para baixo 2-3 vezes).
   3. Transferir a suspensão de células para uma placa de cultura de tecidos de 6 poços reves....

Discussão

Nesse protocolo, foram examinados dois métodos representativos de diferenciação das hiPSCs em CTMs20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos os métodos foram capazes de derivar CTMs a parti.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100