Metodologia para Inativação Metabolicamente de Bactérias para Pesquisa de Caenorhabditis elegans

Resumo

A fonte de alimento para Caenorhabditis elegans no laboratório é Escherichia coli viva. Como as bactérias são metabolicamente ativas, elas apresentam uma variável de confusão em estudos metabólicos e de drogas em C. elegans. Um protocolo detalhado para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído é descrito aqui.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo comum para pesquisa em genética, desenvolvimento, envelhecimento, metabolismo e comportamento. Como C. elegans consomem uma dieta de bactérias vivas, a atividade metabólica de sua fonte alimentar pode confundir experimentos que procuram os efeitos diretos de várias intervenções sobre o verme. Para evitar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano, os pesquisadores de C. elegans usaram vários métodos para inativar metabolicamente as bactérias, incluindo irradiação ultravioleta (UV), morte por calor e antibióticos. O tratamento UV é relativamente baixo rendimento e não pode ser usado em cultura líquida porque cada placa deve ser examinada para matar bactérias com sucesso. Um segundo método de tratamento, o termo-matança, afeta negativamente a textura e a qualidade nutricional das bactérias, levando à parada do desenvolvimento de C. elegans. Finalmente, o tratamento com antibióticos pode alterar diretamente a fisiologia de C. elegans , além de prevenir o crescimento bacteriano. Este manuscrito descreve um método alternativo para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído (PFA). O tratamento com PFA faz ligações cruzadas de proteínas dentro das células bacterianas para prevenir a atividade metabólica, preservando a estrutura celular e o conteúdo nutricional. Este método é de alto rendimento e pode ser usado em cultura líquida ou placas sólidas, pois o teste de uma placa de bactérias tratadas com PFA para crescimento valida todo o lote. A inativação metabólica através do tratamento com PFA pode ser usada para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de suplementação de drogas ou metabólitos, resistência ao estresse, metabolômica e comportamento em C. elegans.

Introdução

Caenorhabditis elegans foi originalmente proposto como organismo modelo em 1965¹ e desde então tem sido amplamente adotado em estudos de genética, desenvolvimento, comportamento, envelhecimento e metabolismo². Devido ao seu grande tamanho de ninhada e cutícula transparente, C. elegans é particularmente adequada para triagem de alto rendimento com repórteres fluorescentes³. Seu curto ciclo de vida, reprodução hermafrodita e homologia genética com humanos também fazem de C. elegans um valioso sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento⁴ e bi....

Protocolo

1. Inoculação de bactérias

1. Preparar o caldo Luria (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 mL de água destilada.
2. Ajustar o pH do LB para 7,0 adicionando hidróxido de sódio (NaOH) 5M. Isso deve exigir apenas cerca de 0,2 mL de NaOH.
3. Autoclave o meio LB ajustado ao pH em um ciclo líquido por 45 min a 15 psi. Deixe a solução arrefecer e armazenar à temperatura ambiente.
4. Inocular uma única colônia de bactérias em 100 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL. Cultivar as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitação a 37 °C.
5. Depend....

Discussão

Benefícios da morte por PFA em relação a outros métodos de eliminação bacteriana
O tratamento com PFA é um método de alto rendimento para prevenir o metabolismo bacteriano, mantendo uma fonte de alimento nutritivo para C. elegans. Matar bactérias através do tratamento com PFA tem múltiplas vantagens sobre outros métodos. Ao contrário do tratamento UV, onde cada placa deve ser testada para matar com sucesso, uma única placa de um lote de bactérias tratadas com PFA pode ser testa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255