Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem quantitativa para medir a autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem.

Resumo

As bactérias benéficas e probióticas desempenham papéis essenciais em seus hospedeiros, proporcionando vários benefícios à saúde, incluindo imunidade a doenças infecciosas. A família Lactobacillaceae consiste em bactérias Gram-positivas com propriedades probióticas confirmadas. Este estudo utiliza espécies de Lactobacillaceae como modelo para demonstrar a eficácia da análise de alto rendimento de célula única no estudo da agregação celular. O foco está em analisar a resposta dessas espécies benéficas aos carboidratos simples da dieta.

O estudo mostra como a citometria de fluxo de imagem (IFC) pode superar as diferenças fundamentais na montagem de bactérias probióticas na presença e ausência de carboidratos. O IFC combina o poder e a velocidade da citometria de fluxo convencional com a resolução espacial da microscopia, permitindo medições morfométricas complexas de alta taxa de maneira fenotipicamente definida em uma biblioteca de cepas e condições bacterianas benéficas. Este protocolo fornece informações sobre a autoagregação de espécies de Lactobacillaceae e lança luz sobre sua resposta aos carboidratos da dieta, contribuindo para a compreensão dos mecanismos por trás dos efeitos benéficos dessas bactérias probióticas.

Introdução

A autoagregação bacteriana é considerada uma etapa primária na formação do biofilme. Nesse processo (às vezes também chamado de autoaglutinação ou floculação), bactérias do mesmo tipo formam aglomerados multicelulares que eventualmente se depositam no fundo dos tubos de cultura ou se ligam ao tecido ou superfície alvo¹.

A autoagregação é um fenômeno amplamente observado e foi demonstrado até agora em patógenos Gram-negativos, como o patógeno oportunista Acinetobacter baumannii², o patógeno dentário Aggregobacter actinomycetemcomitans³ e o patógeno emergente Burkholderia pseudomallei⁴. A autoagregação também foi descrita em várias cepas Gram-positivas probióticas 5,6,7,8. Em Lactobacillus (L.) acidophilus, a autoagregação foi parcialmente mediada por proteínas da camada S e correlacionada com uma adesão à xilana⁷. Da mesma forma, encontramos uma correlação entre a autoagregação dependente de glicose e a indução das propriedades adesivas (julgadas pela adesão à mucina) das espécies probióticas Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei e Lactiplantibacillus plantarum⁵. O aumento da autoagregação provavelmente refletiu mudanças na expressão de adesinas celulares em resposta à glicose e seus catabólitos⁹. Embora os mecanismos moleculares de autoagregação ainda não tenham sido determinados, foi demonstrado que esse processo altera o fenótipo das bactérias agregadas e lhes concede maior tolerância a estressores ambientais¹, bem como maior sensibilidade a moléculas sensíveis a quorum¹⁰.

Várias abordagens têm sido usadas para medir a autoagregação; Uma abordagem experimental é deixar as culturas repousarem estaticamente em tubos de cultura estreitos por um determinado tempo. As culturas de controle permanecem turvas, enquanto as culturas de autoagregação se depositam no fundo do tubo. Uma abordagem mais quantitativa mede a autoagregação por ensaio de sedimentação ou sedimentação¹¹.

A citometria de fluxo também tem sido cada vez mais empregada nos últimos anos para investigar a autoagregação bacteriana. Este método é apropriado para analisar partículas entre aproximadamente 0,5 e 1000 μm de tamanho. A bactéria única ou agregados formados são suspensos em fluido, alimentados em um fluxo e podem ser detectados um a um¹¹. O registro da luz espalhada para frente permite medir o tamanho relativo da célula ou agregado. É relativamente rápido e direto, mas não pode detectar vários parâmetros, como o tamanho do agregado ou o número médio de células em agregados. Portanto, essa abordagem pode ser complementada microscopicamente, permitindo que mais parâmetros sejam verificados¹². No entanto, a microscopia tradicional é demorada e, portanto, limita o número de amostras testadas e o poder estatístico da análise. Em geral, a citometria de fluxo de imagem fornece vários recursos em comparação com a citometria de fluxo tradicional, como análise simultânea da morfologia celular e fenótipo, realização de análise baseada em imagem, detecção de eventos raros e validação de dados de citometria de fluxo¹³. Essas vantagens aumentam as capacidades da citometria de fluxo e facilitam um exame mais detalhado das populações de células.

Este estudo fornece um protocolo valioso para citometria de fluxo de imagem para monitorar a autoagregação em bactérias do ácido lático (BAL). Esses bastonetes Gram-positivos são anaeróbios facultativos e pertencem ao grupo LAB. Esses eficientes fermentadores de glicose geram ácido lático como seu principal produto final do metabolismo dos carboidratos¹⁴. Essas bactérias são membros benéficos do microbioma e são encontradas naturalmente no trato gastrointestinal (TGI) de humanos e animais, bem como no trato urogenital das mulheres¹⁵. Portanto, a caracterização exata de suas propriedades de autoagregação é de alto interesse biotecnológico e clínico.

Nossos achados anteriores indicaram que o nível basal de autoagregação difere entre diferentes cepas probióticas. Essa heterogeneidade é afetada pelos diferentes carboidratos utilizados como fonte de carbono⁵. Para superar essa propriedade fundamental das bactérias probióticas, os efeitos dos carboidratos da dieta foram monitorados na autoagregação no nível de célula única usando IFC. Essa abordagem baseada em IFC combina a potência e a velocidade dos citômetros de fluxo tradicionais com a resolução do microscópio. Portanto, permite medidas morfométricas complexas de alta taxa de forma fenotipicamente definida^16,17. Essa abordagem pode ser estendida a outras bactérias probióticas e patogênicas, combinadas com repórteres fluorescentes para monitorar a expressão gênica e cepas marcadas com fluorescência para monitorar a presença e abundância de espécies bacterianas específicas em agregados heterogêneos.

Protocolo

O arquivo .ast, com o modelo para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como exemplo, é fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1.

1. Preparação de mídia

1. Prepare o caldo Lactobacilli MRS seguindo as instruções do fabricante (55 g em 1 L de água deionizada) e placas de ágar Lactobacilli MRS com ágar 1,5% (p/v) (ver Tabela de Materiais). Após a esterilização em autoclave, o meio está pronto para uso direto ou pode ser armazenado a 4 °C.
2. Prepare 50% (15 g em 1 L de água deionizada) de caldo de soja tríptico (TSB) (ver Tabela de Materiais), TSB suplementado com 1% (p / v) de D- (+) -glicose e 1% (p / v) de D- (+) -rafinose e, em seguida, autoclave para esterilizar o meio. É preferível armazená-lo a 4 °C para evitar contaminação.
3. Para um meio tamponado com glicose, prepare TSB suplementado com D-(+)-glicose a 1% (p / v), 5 mM de fosfato de potássio monobásico junto com potássio dibásico e 100 mM MOPS (ácido propano sulfônico 3-(N-morfolino), consulte a Tabela de Materiais) pH 7. Em seguida, autoclave para esterilizar o meio.

2. Preparação das amostras

NOTA: Esta etapa envolve a avaliação da agregação celular em resposta ao açúcar fermentável ou não fermentável de nossa dieta. Uma representação esquemática do processo de preparação da amostra é representada na Figura 1.

1. Retire a cepa de Lactobacillaceae de um estoque de glicerol congelado (50% de glicerol) em um prato de caldo Lactobacilli MRS (1,5% de ágar).
   NOTA: No experimento de exemplo apresentado aqui, foram utilizadas cepas probióticas de Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) e Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Para expandir essa metodologia para membros probióticos adicionais do filo firmicutes, foi selecionado Bacillus coagulans (ATCC 10545).
2. Cultive as células durante a noite a 37 °C em condições estáticas.
3. Inocular 5 ml de caldo de Lactobacilos MRS com uma única colónia e cultivá-lo a 37 °C em condições estáticas durante a noite.
4. Dilua a cultura de células da etapa anterior (1:100) em 3 mL de caldo de soja tríptico (TSB) a 50%, TSB suplementado com D-(+)-glicose a 1% (p/v) ou TSB suplementado com D-(+)-rafinose a 1% (p/v).
5. Incubar durante a noite a 37 °C em condições estáticas.
6. Prepare a amostra misturando as células uniformemente no meio e vortex suavemente o tubo de cultura de células da etapa 2.5. Inverta suavemente o tubo de ensaio até que a mistura completa ocorra. Transfira 200-300 μL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: É essencial não sonicar a amostra para evitar a quebra dos agregados. Durante a aquisição de dados das etapas 3.4 a 3.10, pode haver casos em que as amostras estejam muito concentradas. Se se verificar que a amostra está a correr muito lentamente ou que não está a correr, pode-se diluir a amostra com o meio fresco adequado.

3. Aquisição de dados

1. Configure o citômetro de fluxo de imagem de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. Defina o laser de 785 nm para 5 mW para medição de campo escuro (equivalente ao espalhamento lateral na citometria de fluxo convencional, abreviado como SSC). Use uma lente de 60x com uma abertura numérica (NA) de 0,9, selecione alta sensibilidade e defina a velocidade para baixa.
3. Antes de coletar qualquer dado, certifique-se da estabilidade do fluxo dos grânulos de calibração no canal SSC. Clique no botão play na caixa "fluidics" e examine a qualidade das imagens das contas. As imagens das contas devem parecer nítidas e nítidas.
4. Pressione o botão Carregar e coloque um tubo com uma amostra (da etapa 2.6) no suporte.
5. Crie um novo gráfico de dispersão na caixa "área de trabalho". Clique em Novo gráfico de dispersão e selecione a área no canal de campo claro correspondente à intensidade do canal SSC. Exclua os grânulos de calibração que são executados no instrumento junto com a amostra.
   NOTA: Os grânulos podem ser excluídos carregando uma amostra apenas com tampão e identificando os grânulos na área vs. Gráfico SSC. Em seguida, desenhe um portão ao redor da população de contas usando o botão Criar região de polígono .
6. Na caixa "Configurações de aquisição", insira o nome da amostra, especifique o local para o armazenamento de dados, escolha a população (todas as células sem contas) para registrar e defina o número de eventos a serem coletados. Normalmente, 10.000 a 20.000 eventos são suficientes.
7. Clique no botão Gravar localizado na caixa "Aquisição" e o processo de aquisição terminará automaticamente assim que o número especificado de eventos for atingido.
8. Clique no botão Retornar para descarregar o tubo e remova o tubo do suporte quando solicitado em uma pequena janela.
9. Repita as etapas 3.5 a 3.9 para cada amostra.
10. Salve o modelo para manter a uniformidade da aquisição de dados para repetições subsequentes.

4. Análise dos dados

1. Meça a porcentagem (%) de autoagregação da população.
   1. Analise os dados adquiridos no citômetro de fluxo de imagem usando o software IDEAS (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Crie um arquivo de análise de dados (.daf) a partir do arquivo bruto (.rif) carregando o arquivo (.rif) no software de análise. Clique no botão Arquivo e abra o arquivo (.rif) necessário. Na janela aberta, clique em usar análise de aquisição e, em seguida, clique em OK.
   3. Crie um histograma de gradiente RMS (uma medida de contraste e foco da imagem) no canal de campo claro para identificar eventos focados. Na área de análise, clique no botão Novo histograma . Na janela "Novo histograma", escolha a população da aquisição a ser analisada e, na "feição do eixo x", selecione Gradiente RMS do canal de campo claro.
      1. Coloque uma porta clicando no botão Criar região de linha na área de análise para excluir eventos não focados (Figura 2A).
         NOTA: Normalmente, a região da linha "Focada" deve incluir 80% a 90% dos eventos com a pontuação RMS de gradiente mais alta, mas limites específicos para células "em foco" devem ser determinados para cada configuração experimental.
   4. Crie um gráfico de dispersão da área (μm²) em relação à proporção (largura dividida pelo comprimento de uma elipse de melhor ajuste) do canal de campo claro. Pressione o botão Novo gráfico de dispersão na área de análise. Na janela "Novo gráfico de dispersão", escolha a população focada na etapa 4.1.3.
      1. Selecione Área do canal de campo claro para o recurso do eixo x e Taxa de proporção do canal de campo claro para o recurso do eixo y. Este gráfico de dispersão permite que a população focada distinga singlets e pequenos eventos agregados de agregados e cadeias microbianas maiores.
   5. Neste gráfico de dispersão, desenhe uma porta usando o botão Criar Região de Retângulo (ou Criar Região de Polígono) com base no valor da área para a população de eventos de agregação e outra porta para a população de singlets e pequenas agregações (Figura 2B).
      NOTA: Em certos contextos, separar pequenos agregados de singlets pode ser um desafio, para que possam ser combinados no mesmo portão. O mesmo se aplica a agregados e cadeias maiores (Figura 3).
   6. Revise e avalie manualmente as imagens de eventos dentro de cada portão para verificar a confiabilidade da estratégia de gating. Se necessário, ajuste o valor da área para o portão. Faça isso selecionando a população revisada no menu suspenso "Populações".
      NOTA: O gating não tem valor de área específico, pois pode variar dependendo das características das bactérias que estão sendo analisadas.
   7. Salve a análise de dados como um modelo. Clique na guia Arquivo , selecione Salvar como Template.ast e abra o próximo arquivo de amostra (.rif) no mesmo modelo para criar o arquivo de análise de dados (.daf) (Compatível com o arquivo .ast como exemplo para LGG).
   8. Crie uma tabela de estatísticas para enumerar os principais eventos para análise posterior. Clique na guia Relatórios e, em seguida, clique em Definir relatório de estatísticas.
   9. Na nova janela, clique em Adicionar Colunas. Adicione a contagem de singlets/agregados e as estatísticas de %gated. Em "estatísticas", escolha %gated/count e, na população selecionada, escolha singlets/agregados. Clique em Adicionar estatísticas para adicionar a estatística à lista e salvá-la como um modelo.
   10. Clique em Gerar relatório estatístico e escolha o modelo estatístico e os arquivos (.daf) para análise.
2. Meça a distribuição de tamanho dos agregados.
   1. Para analisar o tamanho médio dos eventos de agregação, plote um histograma da área (μm²) da população de eventos de agregação da etapa 4.1.5 (Figura 2C).
   2. Salve a análise de dados como um modelo. Clique na guia Arquivo , selecione Salvar como Modelo e abra o próximo arquivo de exemplo (.rif) no mesmo modelo para o arquivo de análise de dados (.daf).
   3. Repita as etapas 4.1.7 a 4.19. Para o tamanho das agregações, escolha média em estatísticas e selecione agregações na população selecionada. Em recursos, selecione Área do canal de campo claro. Clique em Adicionar estatísticas para adicionar a estatística à lista e salvá-la como um modelo.
   4. Repita a etapa 4.1.9 para gerar um relatório estatístico.

Resultados

Os resultados demonstram que este método pode medir facilmente as diferenças na autoagregação em resposta aos açúcares da dieta em bactérias LAB. Ao separar os indivíduos dos agregados, o método permite calcular a porcentagem da população dos eventos de agregação de todos os eventos em resposta aos açúcares fermentáveis ou não fermentáveis da dieta. Além disso, foi possível medir se há diferenças no tamanho médio da população agregada entre os tratamentos.

As imagens r...

Discussão

A citometria de fluxo é um método amplamente utilizado para quantificar intensidades de fluorescência em células eucarióticas, mas pode não fornecer medições precisas para células bacterianas devido ao seu tamanho maior ou agregados pequenos. Esses fatores podem impactar significativamente a quantificação precisa da autoagregação e o nível basal de formação de agregados em diferentes condições. Para resolver isso, a citometria de fluxo de imagem (IFC) foi empregada para obter uma melhor resolução de c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G