Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta que expressam GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para investigar eventos ictais em adultos com Drosophila através de imagens ex vivo de cálcio, permitindo a exploração dos potenciais mecanismos de epilepsia em nível celular.

Resumo

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por crises recorrentes, parcialmente correlacionadas com a origem genética, afetando mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da importância clínica da epilepsia, a análise funcional da atividade neural no sistema nervoso central ainda precisa ser desenvolvida. Avanços recentes na tecnologia de imagem, em combinação com a expressão estável de indicadores de cálcio codificados geneticamente, como o GCaMP6, revolucionaram o estudo da epilepsia em níveis de resolução de células únicas e cerebrais. Drosophila melanogaster tem emergido como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à epilepsia devido à sua sofisticada genética molecular e ensaios comportamentais. Neste estudo, apresentamos um protocolo novo e eficiente para imagens ex vivo de cálcio em Drosophila adulta com GCaMP6 para monitorar atividades epileptiformes. Todo o cérebro é preparado a partir de cac, um gene bem conhecido da epilepsia, moscas knockdown para imagens de cálcio com um microscópio confocal para identificar a atividade neural como um acompanhamento do ensaio de comportamento semelhante a uma convulsão sensível ao bang. As moscas knockdown mostraram uma taxa mais alta de comportamento semelhante a convulsões e atividades anormais de cálcio, incluindo mais picos grandes e menos pequenos picos do que moscas selvagens. As atividades de cálcio foram correlacionadas com o comportamento semelhante a uma crise. Esta metodologia serve como uma metodologia eficiente na triagem de genes patogênicos para epilepsia e na exploração do mecanismo potencial da epilepsia em nível celular.

Introdução

A epilepsia, uma complexa desordem neurológica crônica caracterizada pela recorrência de crises espontâneas e não provocadas e atividade aberrante da rede neuronal, tem afetado mais de 70 milhões de indivíduos em todo o mundo, tornando-se uma das doenças neurológicas mais comuns¹ e levando à sobrecarga das famílias e da sociedade. Em consideração ao impacto da epilepsia, muitos estudos têm sido realizados para identificar a etiologia das crises, cuja genética tem sido aprovada como causa primária de muitos tipos de epilepsias ou síndromes epilépticas2. Nas últimas décadas, os avanços nas tecnologias genômicas levaram a u....

Protocolo

1. Protocolo para ensaio bang-sensitive

1. Estabelecer as moscas experimentais cruzando a linha condutora tub-Gal4 com a linha UAS-cac-RNAi através do sistema Gal4/UAS²¹. Coletar as moscas virgens da linhagem tub-Gal4 e as moscas machos da linhagem UAS-cac-RNAi . Em seguida, transfira as moscas virgens e machos para o mesmo frasco para colher a prole.
   NOTA: A linha de driver tub-Gal4 permitirá alcançar o knockdown global do gene cac . Use a linha UAS-cac-RNAi como grupo controle.
2. Após 3-5 dias de eclosão, anestesiar suavemente as moscas usando o ....

Discussão

O íon cálcio serve como um segundo mensageiro crucial, desempenhando um papel fundamental em uma série de respostas fisiológicas e fisiopatológicas a perturbações químicas e elétricas. Além disso, o elemento topológico dos canais P/Q pré-sinápticos, codificado pelo gene CACNA1A humano, tem sido identificado como responsável pela descarga de vários neurotransmissores, incluindo o glutamato 30,31,32, e está intimamente ligado à epilepsia

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background