Um modelo de rato de acne composta

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para induzir a inflamação da acne na pele de ratos com ácido oleico e Cutibacterium acnes.

Resumo

A acne vulgar é uma condição crônica prevalente da pele caracterizada pela presença de comedões, pápulas e pústulas no rosto, pescoço e tórax. Para simular a inflamação da acne vulgar, este protocolo detalha uma abordagem para estabelecer um modelo composto de roedor de acne induzindo inflamação da acne em orelhas de ratos usando ácido oleico e Cutibacterium acnes (C. acnes). Os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo controle normal (CN), orelhas tratadas com ácido oleico (OA), orelhas tratadas com C . acnes (C. acnes), orelhas tratadas com ácido oleico e C. acnes (OA + C. acnes). Para mimetizar a produção excessiva de sebo, o ácido oleico foi espalhado nas orelhas de ratos dos grupos OA e OA + C. acnes por 25 dias.

Dos dias 21 a 25, a suspensão de C. acnes foi injetada por via intradérmica nas orelhas de ratos dos grupos C. acnes e OA + C. acnes para agravar a inflamação da acne. A espessura da orelha foi medida semanalmente como um indicador da gravidade da inflamação. Foram realizadas observação macroscópica, coloração de hematoxilina e eosina e imuno-histoquímica (IHQ) e os resultados mostraram que as orelhas do grupo OA e do grupo OA + C. acnes estavam espessadas e endurecidas, acompanhadas de eritema e presença de comedões. Além disso, pápulas foram observadas nos grupos C. acnes e OA + C. acnes . A histopatologia exibiu hiperqueratinização e infundíbulo expandido dos folículos pilosos nos grupos OA e OA + C. acnes . Infiltração de células inflamatórias e abscessos foram encontrados na derme dos grupos C. acnes e OA + C. acnes . Os resultados da IHQ confirmaram níveis aumentados de fator de necrose tumoral (TNF)-α na derme dos grupos C. acnes e OA + C. acnes . Todos os resultados acima indicaram coletivamente o estabelecimento bem-sucedido do modelo composto de roedores de acne.

Introdução

A acne vulgar é uma doença cutânea crônica comum caracterizada pela presença de comedões, pápulas e pústulas na face, pescoço e tórax, que, em casos graves, podem evoluir para nódulos, cistos e cicatrizes permanentes¹. Estudos epidemiológicos relatam que a acne afeta 9,4% da população global, enquanto seus sintomas resultantes representam graves desafios físicos e psicossociais ^2,3.

A patogênese da acne é multifatorial, incluindo quatro processos críticos: excesso de produção de sebo, formação de comedões, colonização folicular pela microbiota da pele e liberação de mediadores inflamatórios ao redor da unidade pilossebácea ^4,5. O aumento da secreção de sebo, resultando no acúmulo de excesso de ácidos graxos livres insaturados (AGNIs), contribui para a reprodução anormal da microbiota da pele, uma das quais é o Cutibacterium acnes, como mostrado em estudos genômicos⁶. Enquanto isso, a microbiota da pele decompõe o sebo e aumenta a concentração de UFFAs, levando a um círculo vicioso⁷. Além disso, o excesso de UFFAs causa hiperqueratinização nos folículos pilosos, o que, por sua vez, desencadeia a acne⁸. A microbiota da pele e o aumento do sebo ativam os receptores do tipo Toll (TLRs) para produzir múltiplas citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina (IL)-1 e o TNF-α ^9,10. Essa cascata de inflamação, juntamente com o aumento do sebo e o crescimento excessivo de micróbios, culmina em hiperqueratose pronunciada do folículo piloso e no aparecimento de acne¹¹.

O rápido desenvolvimento no campo da pesquisa da acne e os requisitos clínicos relacionados levaram à criação de uma série de modelos animais de inflamação da acne na orelha de rato, nas costas de ratos ou camundongos e na orelha de coelho 12,13,14,15. Os métodos incluem injeção intradérmica de C. acnes, a aplicação de óleos na pele para simular a secreção anormal das glândulas sebáceas e hiperqueratinização, ou uma combinação de ambos para acelerar a inflamação da pele para formar acne 16,17,18,19. No entanto, o uso e a dosagem de agentes químicos e agentes biológicos variam entre estudos anteriores, o que pode confundir os pesquisadores que pretendem estabelecer um modelo adequado de acne. Este estudo teve como objetivo estabelecer um método fácil de operar e eficaz para formar um modelo composto de roedor de acne e fornecer uma referência de modelo para pesquisadores que estudam acne vulgar.

Protocolo

Este protocolo recebeu aprovação ética da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (No.2023033103-1183). Doze ratos Sprague-Dawley machos (peso, 208 g ± 5 g) foram utilizados neste protocolo e divididos em quatro grupos: grupo NC (n = 3), grupo OA (n = 3), grupo C. acnes (n = 3) e grupo OA + C. acnes (n = 3).

1. Desenvolvendo o modelo de acne

1. Meça e registre a espessura das orelhas de rato usando um paquímetro eletrônico (consulte a Tabela de Materiais) antes da modelagem.
   1. Coloque a mandíbula externa do paquímetro eletrônico no ponto médio da borda externa da orelha e estenda-a até o canal auditivo. Registre a espessura de 2/3 pontos e a espessura de 1/2 pontos ao longo da linha. Meça cada ponto 3x e calcule os valores médios da espessura de dois pontos para ser considerada a espessura da orelha.
2. Incline a cabeça do rato para um lado, faça a orelha voltada para cima e aplique 50 μL de ácido oleico (ver Tabela de Materiais) nos lados ventral e dorsal da orelha uniformemente, uma vez ao dia, por 25 dias.
3. Do dia 21 ao dia 25, diariamente antes da aplicação do ácido oleico, anestesiar os ratos com isoflurano a 4% e, em seguida, injetar 50 μL de suspensão de C. acnes 1 ×^{10 7} UFC (ver Tabela de Materiais) por via intradérmica na superfície ventral da orelha usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 34 G ou 36 G (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Tome cuidado para evitar vasos sanguíneos no ouvido ao injetar por via intradérmica. É necessária uma microseringa com agulha de 34 G ou 36 G (ver Tabela de Materiais). Para garantir a injeção intradérmica adequada, a agulha deve ser perfurada em um ângulo de 10 a 15 graus, com uma profundidade de aproximadamente 1 mm.
4. No dia 25, meça e registre a espessura das orelhas, conforme descrito na etapa 1.1.
   NOTA: O grupo OA foi esfregado apenas com ácido oleico, conforme descrito na etapa 1.2, e injetado com soro fisiológico do 21º ao 25º dia. O grupo C. acnes foi injetado apenas por via intradérmica por suspensão de C. acnes , conforme descrito na etapa 1.3. O grupo OA + C. acnes foi tratado com ácido oleico e suspensão de C. acnes , conforme descrito nas etapas 1.2 e 1.3.

2. Coleta e análise de tecidos

1. No dia 26, depois que os ratos são sacrificados humanamente usando um método aprovado institucionalmente, perfure o tamanho fixo nas orelhas bilaterais com uma broca de anel de 8 mm.
2. Mergulhe os tecidos da orelha em paraformaldeído a 4% por 24 h, seguido de inclusão em parafina e corte em fatias de 5 μm de espessura para coloração de hematoxilina e eosina (HE)²⁰. Observe os cortes em um microscópio óptico e registre as alterações patológicas para avaliação de acompanhamento por um patologista. Atribua pontuações às alterações patológicas de acordo com a Tabela 1 (ver também Figura 1).
3. Desparafinize, reidratie e aqueça as seções para recuperação de antígenos. Inativar peroxidases endógenas incubando com 0,3% de H₂O₂ em metanol por 15 min à temperatura ambiente.
4. Lave as seções com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incube-as com BSA a 3% por 30 min em temperatura ambiente.
5. Incubar as secções com anticorpo monoclonal TNF-α (diluição 1:800) (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
6. Lave as seções com PBS novamente e incube com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (consulte a Tabela de Materiais) por 50 min.
7. Após outra lavagem com PBS, aplique a mistura de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) nas lâminas e monitore o processo de coloração ao microscópio, interrompendo a reação com PBS quando a intensidade desejada for atingida.
8. Contra-core as seções com hematoxilina de Meyer por 1 min, enxágue-as com água corrente, desidrate e monte as seções. Observe os cortes ao microscópio e registre as alterações patológicas para avaliação de acompanhamento por um patologista.

3. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas.
2. Apresente os dados como média ± desvio padrão. Acesse a normalidade de todos os dados usando o teste de Shapro-Wilke. Se seguir uma distribuição normal, use ANOVA unidirecional para avaliar diferenças significativas. Para dados não normalmente distribuídos, aplique o teste de Kruskal-Wallis seguido pelas comparações múltiplas de Dunn. Um valor de p menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Espessura e aparência da pele
Do dia 7 ao dia 21, as orelhas do grupo OA e do grupo OA + C. acnes foram significativamente mais espessas do que as dos grupos NC e C. acnes . No dia 25, as orelhas do grupo OA, grupo C. acnes e grupo OA + C. acnes eram significativamente mais espessas do que as do grupo NC (p < 0,05). A espessura média das orelhas durante o experimento é mostrada na Figura 2 e...

Discussão

Como a metodologia e os critérios de avaliação de um modelo de acne não eram claros, este protocolo teve como objetivo fornecer uma referência para os pesquisadores que estudam a acne. Devido ao pequeno tamanho da orelha do rato e à interferência causada pelo crescimento de pelos nas costas, o uso de creme depilatório e barbeador, a orelha do rato pode ser uma alternativa melhor para estabelecer um modelo de acne em roedores. Tentamos criar o modelo de acne na pele posterior de r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg