A combinação de fração vascular estromal isolada mecanicamente e hidrogel de fibrina: um protocolo de processamento

Resumo

A fração vascular estromal isolada mecanicamente (SVF) em combinação com um hidrogel de fibrina oferece um transportador fácil e eficiente para células estromais derivadas de tecido adiposo viáveis para várias indicações, incluindo engenharia de tecidos e/ou fins de cicatrização de feridas. Aqui, apresentamos a preparação de uma construção mecânica de SVF (mSVF)-hidrogel de fibrina para pesquisa translacional e aplicação clínica.

Resumo

O potencial regenerativo das células estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs) ganhou atenção significativa na pesquisa regenerativa e translacional. No passado, a extração dessas células do tecido adiposo exigia um processo baseado em enzimas em várias etapas, resultando em uma mistura de células heterogêneas consistindo de ACSs e outras células, que são denominadas conjuntamente de fração vascular estromal (SVF). Os protocolos de isolamento mecânico SVF (mSVF) introduzidos mais recentemente são menos demorados e ignoram as preocupações regulatórias. Recentemente, propusemos um protocolo que gera mSVF rico em células estromais com base em uma combinação de emulsificação e centrifugação. Um problema atual na aplicação de mSVF para aplicação de terapia de feridas é a falta de um andaime que forneça proteção contra manipulação mecânica e dessecação. Os hidrogéis de fibrina demonstraram ser um adjuvante útil na transferência de células para fins de cicatrização de feridas no passado. No trabalho aqui, delineamos as etapas de preparação de uma construção de hidrogel mSVF-fibrina como uma nova abordagem para pesquisa translacional e aplicação clínica.

Introdução

Nos últimos anos, a cirurgia plástica regenerativa surgiu como um pilar adicional da cirurgia plástica¹. A cirurgia plástica regenerativa visa restaurar o tecido danificado por meio da transferência de fatores solúveis, células e tecidos colhidos do paciente para promover a restauração tecidual de maneira minimamente invasiva². As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) ganharam atenção devido à sua capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens mesenquimais, tornando-as candidatas promissoras para a pesquisa em medicina regenerativa^....

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os doadores adultos forneceram consentimento informado por escrito para permitir o uso posterior das amostras de tecido coletadas. O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos de nossa instituição.

1. Colheita de tecido adiposo

1. Colher o tecido adiposo realizando uma lipoaspiração padrão em uma técnica convencional de coleta de gordura descrita em publicações anteriores^26,27. Certifique-se de usar uma solução tumesce....

Discussão

O isolamento mecânico da SVF fornece uma alternativa elegante à abordagem enzimática tradicional e oferece amplo acesso para aplicação clínica²⁹. De fato, a MFV, como proposto no presente manuscrito, já está em uso clínico para o tratamento de cicatrizes de tecidos moles ou como adjuvante para procedimentos estéticos³⁰. O protocolo apresentado aqui fornece um método simples para a entrega tópica eficiente de células mSVF viáve.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Wellplate	Sarstedt	83.3921
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Biochemica	A1001.0010
50 mL-Falcon	Falcon	352070
Absorbent Towels, Two Pack	Halyard	89701
Alamar blue 25 mL	Invitrogen	DAL1025
Albumin, Bovine (BSA)	VWR	0332-500G
Biotek Cytation 5	Agilent		Cell Imaging Multimode Microplate Reader
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670-500G
Cryostat	Microtome
DMEM with 4,5 g/L glucose,with L-Glutamine, with sodium pyruvate	VWR	392-0416
DPBS	Gibco	14190-144
Epinephrin	Sigma-Aldrich	E4250
Fetal Bovine Serum	Biowest	S181H-500
Fibrinogen Human Plasma 100 mg	Sigma-Aldrich	341576-100MG
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Formalin 4%	Formafix	1308069
FSC 22-Einbettmedium, blau	Biosystems	3801481S
Hematoxylin & Eosin Solution	Sigma-Aldrich	H3136 / HT110132
Lactated Ringer’s Solution 1000 mL	B Braun	R5410-01
Mercedes Cannula 4mm	MicroAire	PAL-R404LL
NaCl 0.9%	Bbraun	570160
OCT Embedding Matrix 125 mL	CellPath	KMA-0100-00A
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	10342243
PBS 1%	Sigma-Aldrich	P4474
PenStrep	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Petridish 150mm	Sarstedt	83.1803
Phalloidin-iFluor 488 Reagent	Abcam	ab176753
Sterile Syringe 20 mL Luer	HENKE-JECT	5200-000V0
Sterile Syringe 30 mL Luer-Lock	BD	10521
Thrombin from Human Plasma	Sigma-Aldrich	T6884-100UN
Tranexamic acid	Orpha Swiss	6837093
Tulipfilter 1.2	Lencion Surgical	ATLLLL
Tulipfilter 1.4	Lencion Surgical	ATLLLL