Um ensaio químico de acetil-clique para medir a acetilação de histona acetiltransferase 1

Resumo

Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.

Resumo

HAT1, também conhecido como Histone acetiltransferase 1, desempenha um papel crucial na síntese de cromatina estabilizando e acetilando H4 nascente antes da montagem do nucleossomo. É necessário para o crescimento do tumor em vários sistemas, tornando-se um alvo potencial para o tratamento do câncer. Para facilitar a identificação de compostos que podem inibir a atividade enzimática do HAT1, desenvolvemos um ensaio de acetil-clique para triagem rápida. Neste ensaio simples, empregamos HAT1/Rbap46 recombinante, que é purificado a partir de células humanas ativadas. O método utiliza o análogo 4-pentynoyl-CoA (4P) do acetil-CoA em uma abordagem de química de cliques. Isso envolve a transferência enzimática de uma alça de alcino através de uma reação de acilação dependente de HAT1 para um peptídeo N-terminal H4 biotinilado. O peptídeo capturado é então imobilizado em placas neutravidina, seguido de funcionalização click-química com biotina-azida. Posteriormente, o recrutamento de estreptavidina-peroxidase é empregado para oxidar o vermelho de amplex, resultando em uma produção fluorescente quantitativa. Através da introdução de inibidores químicos durante a reação de acilação, podemos quantificar a inibição enzimática com base na redução do sinal de fluorescência. É importante ressaltar que essa reação é escalável, permitindo a triagem de alto rendimento de potenciais inibidores da atividade enzimática do HAT1.

Introdução

Dentre as numerosas acetiltransferases eucarióticas, a HAT1 foi a histona acetiltransferase inicial a ser isolada ^1,2,3. Investigações subsequentes estabeleceram firmemente seu papel fundamental na replicação da cromatina, particularmente na síntese de novos nucleossomos durante a fase^{S 4}. Nossos esforços de pesquisa levaram ao reconhecimento de que o HAT1 é altamente estimulado pelo tratamento com fator de crescimento epidérmico (EGF) em células mamárias⁵. Além disso, veio à tona que o TAH1 é necessário para a rápida proliferaç....

Protocolo

1. Método 1: Produção e purificação do complexo recombinante HAT1/Rbap46

1. Descongelamento, recuperação e expansão de células HEK293f
   1. Descongelar 1-10 milhões de células de mamíferos HEK293f²⁶ em 30 mL de meio de expressão freestyle 293 em um frasco de 100 mL. Incubar em 8% CO₂ a 37 °C enquanto gira a 60 rpm.
   2. No dia seguinte, conte e verifique a viabilidade da célula e, em seguida, ajuste a velocidade de rotação para 120 rpm. Expandir para 300 mL de cultura em um frasco de 1 L, mantendo a densidade de semeadura em 500.000 células/mL e dividindo as células antes que a densidade exceda 3 x 10<....

Discussão

Na última década, a química de cliques tornou-se proeminente²⁰, permitindo o projeto preciso de estruturas químicas interagentes. Dentro deste contexto, várias conexões covalentes bioortogonais²¹ têm emergido como opções promissoras para a formação de complexos em seu ambiente natural. A química de cliques emprega pares de grupos funcionais que exibem reações rápidas e seletivas, comumente conhecidas como "reações de clique". Estas reações ocorrem eficien.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher