Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis

Resumo

Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

Resumo

A biossíntese de clorofila é uma marca da desetiolação, uma das fases mais dramáticas do ciclo de vida das plantas. O processo rigidamente controlado e altamente dinâmico de biossíntese de clorofila é desencadeado durante a mudança do escuro para a luz em plantas com flores. No momento em que as plântulas etioladas são expostas aos primeiros vestígios de luz solar, a rápida conversão (em ordem de segundos) de protoclorofilida em clorofilida é mediada por complexos proteicos únicos que aceitam a luz, levando através de etapas metabólicas subsequentes à produção de clorofila totalmente funcional. As técnicas padrão para análise do teor de clorofila incluem a extração de pigmentos de tecidos vegetais destacados, o que não se aplica ao estudo de processos tão rápidos. Para investigar a cinética da clorofila in vivo com alta acurácia e resolução espaço-temporal nas primeiras horas após a desetiolação induzida pela luz, um instrumento e um protocolo foram desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento detalhado desenhado para quantificação estatisticamente robusta de clorofila nos estágios iniciais da desetiolação de Arabidopsis .

Introdução

A desetiolação representa a fase mais dramática do ciclo de vida das plantas, caracterizada por uma série de alterações morfológicas e rearranjo completo do metabolismo vegetal (de hetero para autotrópico)¹. A biossíntese de clorofila é uma característica da desetiolação induzida pela luz em plantas e um processo muito dinâmico. A formação de clorofila a partir de protoclorofilida precursora produzida no escuro deve ser fortemente coordenada para evitar danos causados por subprodutos reativos². A redução do protoclorofilide a clorofilida é catalisada por protoclorofilídeos oxidorredutases (PORs) dependentes de luz, enzim....

Protocolo

1. Preparação do meio

1. Preparar o meio de cultivo misturando 0,75 g de gelificante com 50 mL de água deionizada estéril em um frasco de vidro para atingir uma concentração de 1,5% (p/v) para uma placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente a mistura e, em seguida, aqueça-a no micro-ondas até ferver para dissolver o agente gelificante (a solução torna-se clara).
2. Deixe o meio arrefecer até 58-60 °C antes de prosseguir para os passos seguintes. Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em condições estéreis dentro de uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação.
3. Use placas de Petri com bordas à prova d....

Discussão

Etapas críticas do protocolo e solução de problemas - sem luz e cuide da máscara
Como destacado diretamente na descrição do protocolo acima, evitar até mesmo as quantidades residuais de luz, tanto durante o cultivo de mudas de plantas etioladas ou pouco antes de iniciar o protocolo, é de fundamental importância¹¹. Em nossa configuração, usamos uma câmara escura dedicada localizada no phytotron walk-in e separada do resto do phytotron com porta giratória à prova de.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM