Regulando o crescimento de células de Schwann por campo elétrico pulsado de nanossegundos para regeneração de nervos periféricos in vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para aplicação de campo elétrico de pulso de nanossegundos (nsPEF) para estimular células de Schwann in vitro. A capacidade de síntese e secreção de fatores relevantes e alterações no comportamento celular validaram o sucesso da estimulação usando nsPEF. O estudo dá uma visão positiva do método de regeneração de nervos periféricos.

Resumo

As células de Schwann (SCs) são células mielinizantes do sistema nervoso periférico, desempenhando um papel crucial na regeneração dos nervos periféricos. O Campo Elétrico de Pulso de Nanossegundos (nsPEF) é um método emergente aplicável na estimulação elétrica nervosa que demonstrou ser eficaz na estimulação da proliferação celular e outros processos biológicos. Com o objetivo de avaliar se os SCs sofrem mudanças significativas sob nsPEF e ajudar a explorar o potencial de novos métodos de regeneração de nervos periféricos, as células RSC96 cultivadas foram submetidas à estimulação nsPEF a 5 kV e 10 kV, seguida de cultivo contínuo por 3-4 dias. Posteriormente, alguns fatores relevantes expressos por SCs foram avaliados para demonstrar a estimulação bem-sucedida, incluindo a proteína marcadora específica, o fator neurotrófico, o fator de transcrição e o regulador da mielinização. Os resultados representativos mostraram que o nsPEF aumentou significativamente a proliferação e migração de SCs e a capacidade de sintetizar fatores relevantes que contribuem positivamente para a regeneração dos nervos periféricos. Simultaneamente, a menor expressão de GFAP indicou o prognóstico benigno de lesões de nervos periféricos. Todos esses resultados mostram que o nsPEF tem grande potencial como método de tratamento eficiente para lesões de nervos periféricos, estimulando as SCs.

Introdução

A cada ano, milhões de pessoas são afetadas por lesões nervosas envolvendo tanto o sistema nervoso periférico (SNP) quanto o sistema nervoso central (SNC)¹. Estudos demonstraram que a capacidade de reparo axonal do SNC é bastante limitada após lesões nervosas, enquanto o SNP mostra capacidade aumentada devido à plasticidade significativa das SCs². No entanto, alcançar a regeneração completa após lesões de nervos periféricos permanece árduo e continua a representar um desafio significativo para a saúde humana ^3,4. Atualmente, os autoenxertos continuam sendo um tra....

Protocolo

1. Descongelamento de células RSC96 criopreservadas

1. Descongele o criogênico contendo 1 mL de suspensão celular agitando-o rapidamente em banho-maria a 37 ° C e, em seguida, adicione-o a um tubo de centrífuga contendo 4-6 mL de meio de cultura completo e misture bem.
2. Centrifugue a 1000 x g durante 3-5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 ml de meio de cultura completo.
3. Adicionar a suspensão celular a um balão de cultura (ou cápsula) contendo 6-8 ml de meio de cultura completo e incubar a 37 °C durante a noite.
4. No dia seguinte, observe o crescimento e a densidade celular ao microscópi....

Discussão

Nos últimos anos, a aplicação do nsPEF tem experimentado um crescimento impulsionado, conforme relatado. O nsPEF tem um efeito altamente direcionado apenas na área desejada, fornecendo energia suficiente para tratar sem causar danos térmicos adicionais, tornando-o mais seguro para o corpo humano²⁸. Essas características lhe conferem perspectivas translacionais promissoras no tratamento de tumores e regeneração nervosa. No entanto, alguns estudos propuseram algumas limitações do nsPEF. Co.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100