Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Resumo

Aqui, apresentamos um método simples para observação direta e medida automatizada das respostas estomáticas à invasão bacteriana em Arabidopsis thaliana. Esse método utiliza um dispositivo portátil de imagem estomática, juntamente com um pipeline de análise de imagem projetado para imagens foliares capturadas pelo dispositivo.

Resumo

Os estômatos são poros microscópicos encontrados na epiderme foliar da planta. A regulação da abertura estomática é fundamental não apenas para equilibrar a absorção de dióxido de carbono para fotossíntese e perda de água transpiracional, mas também para restringir a invasão bacteriana. Enquanto as plantas fecham estômatos após o reconhecimento de micróbios, bactérias patogênicas, como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto), reabra os estômatos fechados para ter acesso ao interior da folha. Nos ensaios convencionais de avaliação das respostas estomáticas à invasão bacteriana, cascas epidérmicas foliares, discos foliares ou folhas destacadas são flutuadas sobre suspensão bacteriana e, em seguida, os estômatos são observados ao microscópio seguido da medição manual da abertura estomática. No entanto, esses ensaios são pesados e podem não refletir as respostas estomáticas à invasão bacteriana natural em uma folha aderida à planta. Recentemente, foi desenvolvido um dispositivo portátil de imagem que pode observar estômatos pinçando uma folha sem desprendê-la da planta, juntamente com um pipeline de análise de imagem baseado em aprendizado profundo projetado para medir automaticamente a abertura estomática a partir de imagens foliares capturadas pelo dispositivo. Aqui, com base nesses avanços técnicos, um novo método para avaliar as respostas estomáticas à invasão bacteriana em Arabidopsis thaliana é introduzido. Este método consiste em três etapas simples: inoculação por atomização de Pto mimetizando processos naturais de infecção, observação direta de estômatos em uma folha da planta inoculada com Pto usando o dispositivo portátil de imagem e medição automatizada da abertura estomática pelo pipeline de análise de imagens. Este método foi usado com sucesso para demonstrar o fechamento e a reabertura estomáticos durante a invasão de Pto em condições que mimetizam a interação natural planta-bactéria.

Introdução

Estômatos são poros microscópicos cercados por um par de células de guarda na superfície das folhas e outras partes aéreas das plantas. Em ambientes em constante mudança, a regulação da abertura estomática é fundamental para que as plantas controlem a absorção de dióxido de carbono necessária para a fotossíntese às custas da perda de água via transpiração. Assim, a quantificação da abertura estomática tem sido fundamental para o entendimento da adaptação ambiental das plantas. No entanto, quantificar a abertura estomática é inerentemente demorado e complicado, pois requer trabalho humano para detectar e medir poros estomáticos em uma imagem foliar capturada por um microscópio. Para contornar essas limitações, vários métodos têm sido desenvolvidos para facilitar a quantificação da abertura estomática em Arabidopsis thaliana, uma planta-modelo extensivamente utilizada para estudar a biologia estomática1,2,3,4,5,6. Por exemplo, um porômetro pode ser usado para medir a taxa de transpiração como uma métrica de condutância estomática. Entretanto, este método não fornece informações diretas sobre o número estomático e a abertura que determinam a condutância estomática. Alguns estudos utilizaram técnicas de microscopia confocal destacando poros estomáticos utilizando um marcador fluorescente de actina, um corante fluorescente ou autofluorescência da parede celular ^1,2,3,4,5. Embora essas abordagens facilitem a detecção de estômatos, o custo de operar uma instalação de microscopia confocal e preparar amostras de microscopia pode ser um obstáculo para a aplicação de rotina. Em um trabalho pioneiro de Sai et al., um modelo de rede neural profunda foi desenvolvido para medir automaticamente a abertura estomática a partir de imagens microscópicas de campo claro de peelings epidérmicos de A. thaliana ⁶. No entanto, essa inovação não isenta os pesquisadores da tarefa de preparar um peeling epidérmico para observação microscópica. Recentemente, esse obstáculo foi superado com o desenvolvimento de um aparelho portátil de imagem capaz de observar estômatos pinçando uma folha de A. thaliana, juntamente com um pipeline de análise de imagens baseado em aprendizado profundo que mede automaticamente a abertura estomática a partir de imagens foliares capturadas pelo dispositivo⁷.

Os estômatos contribuem para a imunidade inata das plantas contra patógenos bacterianos. A chave para essa resposta imune é o fechamento estomático que restringe a entrada bacteriana através dos poros microscópicos no interior da folha, onde patógenos bacterianos proliferam e causam doenças⁸. O fechamento estomático é induzido pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs), moléculas imunogênicas que são frequentemente comuns a uma classe de micróbios, por receptores de reconhecimento de padrões localizados na membrana plasmática (PRRs)⁹. Um epítopo de 22 aminoácidos da flagelina bacteriana conhecido como flg22 é um MAMP típico que induz o fechamento estomático através do seu reconhecimento pelo PRR FLS2¹⁰. Como contramedida, patógenos bacterianos como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto) e Xanthomonas campestris pv. vesicatórios desenvolveram mecanismos de virulência para reabrir estômatos9,11,12. Essas respostas estomáticas a patógenos bacterianos têm sido convencionalmente analisadas em ensaios nos quais cascas epidérmicas foliares, discos foliares ou folhas destacadas são flutuadas em suspensão bacteriana e, em seguida, estômatos são observados ao microscópio seguido de medição manual da abertura estomática. No entanto, esses ensaios são pesados e podem não refletir as respostas estomáticas à invasão bacteriana natural que ocorre em uma folha aderida à planta.

Aqui, um método simples é apresentado para investigar o fechamento e a reabertura estomáticos durante a invasão de Pto sob a condição que mimetiza de perto a interação natural planta-bactéria. Este método utiliza o dispositivo portátil de imagem para observação direta de estômatos de A. thaliana em uma folha acoplada à planta inoculada com Pto, juntamente com a tubulação de análise de imagem para medição automatizada da abertura estomática.

Protocolo

1. Plantas em crescimento

1. Para quebrar a dormência, ressuspenda sementes de A. thaliana (Col-0) em água deionizada e incube-as a 4 °C por 4 dias no escuro.
2. Semeie as sementes no solo e cresça em uma câmara equipada com luz fluorescente branca. Manter as seguintes condições de crescimento: temperatura de 22 °C, intensidade luminosa de 6.000 lux (ca. 100 μmol/m²/s) por 10 h e umidade relativa de 60%.
3. Quando necessário, regue as plantas com um fertilizante líquido. Abster-se de regar de 1 semana a 2 dias antes da inoculação e regar bem 1 dia antes da inoculação.

2. Preparação do inóculo bacteriano

1. Streak Pto do estoque de glicerol em meio King's B (KB) solidificado (20 g de triptona, 1,5 g de K₂HPO₄ e 15 g de glicerol para 1 L, ágar 1,5%) com 50 μg/mL de rifampicina e incubar a 28 °C por 2 dias.
2. Inocular uma única colônia a 5 mL de meio líquido KB com 50 μg/mL de rifampicina e incubar a 28 °C com agitação a 200 rpm até a fase logarítmica tardia de crescimento.
3. Centrifugar a cultura a 6.000 x g por 2 min, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de água estéril. Repita esta etapa mais uma vez.
4. Retire o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de abertura dos estômatos (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) e meça o OD₆₀₀.
5. Diluir a suspensão para OD₆₀₀ 0,2 com tampão de abertura dos estômatos contendo tensoativo de silicone a 0,04%.

3. Inoculação por pulverização de bactérias

1. A partir de 1 dia antes da inoculação até o final do experimento, expor as plantas a uma intensidade de luz de cerca de 10.000 lux (ca. 170 μmol/m²/s).
2. Para garantir que a maioria dos estômatos esteja aberta, mantenha as plantas em uma bandeja coberta com uma tampa transparente sob a luz por pelo menos 3 h antes da inoculação por pulverização.
3. Retire a tampa e use um aerógrafo para pulverizar o lado abaxial das folhas com 2,5 mL de suspensão bacteriana por três plantas em um único vaso.
4. Incubar as plantas inoculadas em uma bandeja coberta com tampa transparente para manter uma umidade relativa em torno de 85%.
5. Adquirir imagens de estômatos em 1 h e 3 h após a inoculação por pulverização usando o método descrito na seção 4.

4. Observação direta dos estômatos com o aparelho portátil de imagem

NOTA: O dispositivo portátil de imagem estomática é equipado com uma luz LED e um módulo de câmera e pode adquirir imagens de 2.592 × 1.944 (altura × largura; pixels) com uma resolução de cerca de 0,5 μm/pixel.

1. Conecte o aparelho portátil de imagem estomática a um computador pessoal (PC) equipado com software de aquisição de imagens.
2. Remova suavemente, mas completamente, as gotículas de água das folhas inoculadas com um pedaço de papel.
3. Abra a tampa superior do dispositivo, coloque a folha sobre o palco e feche a tampa superior (Figura 1).
4. Ajuste o foco da imagem manipulando o parafuso do ajustador e clique no botão Salvar imagem na tela do PC. A imagem será adquirida instantaneamente. Normalmente, uma imagem focalizada contém aproximadamente 10 estômatos analisáveis. Para obter resultados robustos, adquira imagens estomáticas de seis folhas de três plantas diferentes (duas folhas por planta).

5. Medição manual da abertura estomática

NOTA: O software ImageJ pode ser baixado em https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Abra um arquivo de imagem no ImageJ.
2. Abra o gerenciador de ROI selecionando Analisar ferramentas > > Gerenciador de ROI.
3. Use a ferramenta de seleção de linha reta para desenhar uma linha correspondente à largura de um estoma (Figura 2) e registre o ROI clicando em Adicionar no Gerenciador de ROI.
4. Traçar uma linha correspondente ao comprimento do mesmo estoma (Figura 2A) e registrar a ROI conforme descrito no passo 5.3.
5. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para medir a largura e o comprimento.
6. Divida a largura pelo comprimento para obter a abertura estomática (razão). Para uma quantificação robusta, utilizar 60 ou mais estômatos para cada tratamento e momento. Não escolher estômatos prematuros ou obscuros para a análise (Figura 2B, C).

6. Medição automatizada da abertura estomática

NOTA: O pipeline de análise de imagens é executado no Google Colaboratory, um ambiente executável da linguagem de programação Python na nuvem. Os usuários devem ter uma conta do Google válida com um Google Drive funcional, navegador Google Chrome e uma conexão estável com a Internet como pré-requisito.

1. Faça o download do bloco de anotações Google Colaboratory de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) e abra o bloco de anotações.
2. Faça uma cópia local do bloco de anotações no Google Drive selecionando Arquivo > Salvar uma cópia no Drive. Depois que uma nova guia for exibida, feche com segurança a guia do bloco de anotações original.
3. Pressione o botão Executar uma vez abaixo da seção Configuração ambiental no bloco de anotações sem desdobrar os blocos de células para importar as bibliotecas necessárias.
4. Execute a seção Configurações do diretório para criar três pastas usadas para análise (por exemplo, example_result, inference_results e modelo) no Google Drive.
   Observação : nesse caso, as pastas chamadas example_result, inference_results e modelo são usadas como o diretório parental, armazenando resultados de inferência e modelos treinados, respectivamente. Este bloco de anotações mostra um exemplo de construção de diretório como um procedimento representativo. Para alterar o nome, reescreva o caminho pardir, infdir ou modeldir .
5. De acordo com a seção Preparação das Imagens , mova as imagens adquiridas para example_result, agrupadas em títulos de imagem por tratamento ou amostra (por exemplo, mock_1h_XXXXXX.jpg) para a geração final do gráfico. Imagens de amostra estão disponíveis em Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. Execute a parte Download Trained Models para baixar os arquivos ONNX dos modelos treinados do Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) e coloque-os sob o diretório do modelo .
7. Execute a parte de Inferência e Medição da Abertura Estomática para quantificar a abertura estomática a partir de imagens individuais. As imagens de resultado com inferência sobreposta e o arquivo csv chamado example_result.csv serão exportados para o diretório inference_results.
8. Execute a seção Geração de Gráfico para criar um gráfico sobre a razão de abertura estomática, exportada para o diretório inference_results .

Resultados

Após a inoculação por atomização do Pto, estômatos nas folhas aderidas às plantas inoculadas foram observados diretamente pelo aparelho portátil de imagem estomática. Usando medidas manuais e automatizadas, as mesmas imagens foliares foram usadas para calcular a abertura estomática, considerando razões entre largura e comprimento de aproximadamente 60 estômatos. Medidas manuais e automatizadas indicaram consistentemente uma diminuição na abertura estomática em plantas inoculadas com Pto e...

Discussão

Estudos prévios utilizaram cascas epidérmicas, discos foliares ou folhas destacadas para investigar respostas estomáticas a invasões bacterianas ^9,11,12. Em contrapartida, o método proposto neste estudo utiliza o aparelho portátil de imagem estomática para observar diretamente estômatos em uma folha aderida à planta após inoculação por atomização por atomização, mimetizando condições naturais de invas?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron