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Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos
* Estes autores contribuíram igualmente
Neste Artigo
Resumo
Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.
Resumo
O sequenciamento de célula única permitiu o mapeamento de populações de células heterogêneas no estroma de órgãos hematopoiéticos. Essas metodologias fornecem uma lente através da qual estudar a heterogeneidade anteriormente não resolvida no estado estacionário, bem como as mudanças na representação do tipo de célula induzidas por estresses extrínsecos ou durante o envelhecimento. Aqui, apresentamos protocolos passo a passo para o isolamento de populações de células estromais de alta qualidade do timo murino e humano, bem como do osso murino e da medula óssea. As células isoladas por meio desses protocolos são adequadas para gerar conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade. Os impactos da digestão da amostra, depleção da linhagem hematopoiética, análise/classificação FACS e como esses fatores influenciam a compatibilidade com o sequenciamento de célula única são discutidos aqui. Com exemplos de perfis FACS indicando dissociação bem-sucedida e ineficiente e rendimentos de células estromais a jusante na análise pós-sequenciamento, são fornecidos indicadores reconhecíveis para os usuários. Considerar os requisitos específicos das células estromais é crucial para a aquisição de resultados reprodutíveis e de alta qualidade que possam avançar o conhecimento na área.
Introdução
No adulto saudável, a produção de novo de células sanguíneas ocorre na medula óssea e no timo. As células estromais nesses locais são essenciais para a manutenção da hematopoiese, mas o estroma constitui menos de 1% do tecido 1,2,3,4. A obtenção de isolados puros de hematopoiese que suportam o estroma, portanto, constitui um desafio significativo, particularmente para multiômica de célula única que requer processamento rápido para obter amostras de alta qualidade. Componentes de diferentes coquetéis de digestão podem interferir em certas eta....
Protocolo
Todo o trabalho com tecido humano foi conduzido após a aprovação do Conselho de Revisão Interna do Hospital Geral de Massachusetts (IRB). Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts (IACUC). Camundongos C57Bl/6, com 8 a 10 semanas de idade, machos e fêmeas, foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação de tecido tímico murino
- Prepare os seguintes tampões e soluções.
- Meio 199 (M199) com 2% (....
Resultados Representativos
Esses protocolos produzem variedades de células estromais reprodutíveis do timo e da medula óssea adequadas para análise de citometria de fluxo, bem como multiômica de célula única, como sequenciamento de scRNA. O tecido tímico murino sofre remodelação significativa em resposta a estressores, como o condicionamento citotóxico que precede o transplante de medula óssea ou o processo natural de envelhecimento. Como consequência, a celularidade tímica é drasticamente reduzida em ambas as configurações (
Discussão
As células estromais em órgãos hematopoiéticos são críticas para a produção normal de sangue e as perturbações do estroma hematopoiético podem resultar em graves prejuízos na manutenção hematopoiética e na resposta ao estresse 9,23,24. O conhecimento das células estromais hematopoiéticas é essencial para a compreensão das doenças hematológicas 7,9,10,24 <.......
Divulgações
D.T.S. é diretor e acionista da Agios Therapeutics e Editas Medicines; fundador, diretor, acionista e membro do conselho consultivo científico da Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, acionista e fundador da Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics, e diretor, fundador e acionista da Clear Creek Bio, consultor da FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio, e beneficiário de financiamento de pesquisa patrocinado pela Sumitomo Dianippon. DTS e K.G são inventores de patentes US20220143099A1.
Agradecimentos
Fomos apoiados com assistência técnica especializada pela instalação de citometria de fluxo HSCI-CRM no Massachusetts General Hospital e no Bauer Core Facility na Universidade de Harvard. T.K e K.G foram apoiados pelo Conselho de Pesquisa Sueco e C.M. pela Fundação Alemã de Pesquisa. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee pela assistência na análise dos dados de sequenciamento de RNA de célula única.
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
Referências
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induc....
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